PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Trypanosoma cruzi NO SORO DE CRIANÇAS DA REGIÃO DE PELOTAS, RS

ARAÚJO, Anelise Bergmann1 ; PEPE, Michele Soares1 ; CORRÊA, Tiago Gallina1; BROD, Claudiomar Soares2; BERNE, Maria Elisabeth Aires1

1 Laboratório de Parasitologia – DEMP – IB/UFPel
 2 Centro de Controle de Zoonoses – DMVP – FAVET/UFPel
Campus Universitário – Caixa postal 354 – CEP 96010-900. anelise_araujo@yahoo.com.br

1. INTRODUÇÃO
	
	A Doença de Chagas, presente somente no continente americano acomete cerca de 16-18 milhões de pessoas, sendo que 90 milhões vivem em área endêmica com risco de contrair a infecção, segundo dados da OMS [13], tendo como agente etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi.  A transmissão ocorre de diversas maneiras entre os hospedeiros, sendo considerada uma zoonose. A transmissão pode ocorrer via vetorial, transfusão sanguínea, transmissão congênita, entre outras, podendo infectar indivíduos em qualquer faixa etária [5,7,9].
	A doença pode manifestar-se com fase aguda, crônica silenciosamente sem manifestações (forma indeterminada) ou crônica sintomática com manifestações clínicas especialmente no coração, esôfago e cólon [5,7,9].
	A detecção de anticorpos contra antígenos de T. cruzi por métodos sorológicos é o principal suporte no diagnóstico da Doença de Chagas. Dentre as técnicas disponíveis, o método de ELISA tem sido amplamente utilizado, tanto em levantamento epidemiológicos como na avaliação de doadores de sangue [13].
	Em estudos realizados em crianças, verificou-se uma percentagem de soropositividade de 0,17% entre menores de 10 anos no município de Berilo, Minas Gerais, no período de janeiro a julho de 1997 [6], enquanto em naturais de Taquarituba, São Paulo, a soropositividade foi de 2,7% (n=2784) no grupo etário de seis a nove anos [3].
	Embora seja uma doença há muito descoberta e estudada, ainda surpreende a população com surtos, incluindo relatos fatais, como ocorrido recentemente no estado vizinho de Santa Catarina [10]. Devido a isto faz-se necessário acompanhamento periódico da população de área endêmica, através de levantamentos soro epidemiológicos a fim de manter sob controle a transmissão dessa doença.	

2. MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem:
A pesquisa foi realizada em 490 amostras de soro de crianças de 1-12 anos obtidas, aleatoriamente, da soroteca do Centro de Controle de Zoonoses da Universidade Federal de Pelotas, referentes ao ano de 1999.

Pesquisa de anticorpos - ELISA
As amostras foram analisadas utilizando-se kit de ELISA da marca Wiener®, disponibilizado para comercialização, com metodologia própria. Este kit apresenta adsorvidos na microplaca os antígenos recombinantes Ag1, Ag2, Ag 13, Ag 30, Ag 36 e Ag SAPA, sendo este último da forma tripomastigota do parasito, forma circulante no indivíduo infectado. 
Descrição da técnica: Adição de 200 µl de diluente de amostras (albumina bovina em solução fisiológica tamponada com tampão fosfato pH 7,2). Adição de 10 µl de amostras e controles negativos e positivos. Incubação por 30 minutos a 37ºC. Lavagem (5 X) com solução de lavagem preparada da diluição de 1 parte de cloreto de sódio 1,4 mmol/L em tampão fosfato 100mmol/L e tensoativo não iônico 0,1 g/L em 4 partes de água destilada. Adição de 50 µl de conjugado, composto de anti-imunoglobulina humana, produzida em cabra, conjugada com peroxidase. Incubação por 20 minutos a 37ºC. Lavagem (5X). Adição de 100 µl de substrato, sendo este preparado de uma mistura de partes iguais de peróxido de hidrogênio 60 mmol/L em tampão citrato 50 mmol/L pH 3,2 com tetrametilbenzidina (TMB) 0,01 mmol/L em ácido clorídrico 0,1N.  Incubação por 20 minutos a 18-25ºC. A reação é interrompida pela adição de 50µl de ácido sulfúrico 2N e a leitura realizada em 450 nm.
Cálculo do cut off média dos controles negativos + 0,300
Os testes de ELISA foram realizados no Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Pelotas.
Todas as amostras que apresentaram absorbância próxima ou superior ao cut off foram novamente analisadas pelo método de ELISA.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

	Das 490 amostras de soro de crianças analisadas pelo método de ELISA, quatro apresentaram-se reagentes, sendo confirmado este resultado após repetição no mesmo teste, representando uma parcela de 0,82% do total de amostras. A análise destes dados fica um pouco comprometida por não estar totalmente definida a delimitação do grupo em amostra, visto que estas foram obtidas de uma soroteca e aliquotadas aleatoriamente. Entretanto, pode-se observar concordância deste resultado com outros obtidos em estudos semelhantes. Em um estudo de soroprevalência de 834 amostras de escolares de 7-14 anos de Londrina, PR em 1995, o percentual de positividade foi de 0,1% [2]. Em 5247 escolares de 7-14 anos de 17 municípios do ES, a soroprevalência realizada em 1999-2000 apresentou apenas um caso positivo (0,019%) [11]. Em inquérito epidemiológico realizado no Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, a soroprevalência em escolares de 7 a 14 anos foi de 0,4% de 1564 amostras [8].
Já em estudos mais direcionados para populações de risco, estes valores mostram-se superiores. No Rio Grande do Sul, em inquérito realizado entre 1970-1975 e 1980-1982 em populações rurais de 17 municípios, os valores de prevalência foram superiores. Na faixa de 0-9 anos, dos 353 examinados, 25 (7,08%) apresentaram-se positivos; na faixa de 10-19 anos, 184 (13,18%) positivos em 1396 analisados, sendo que estes valores elevam-se ainda mais em outras faixas etárias. Em Pelotas, RS, independente de faixa etária, a soroprevalência foi de 9,32% [1]. Entre 410 crianças de 1-10 anos de Nasca, Peru, moradores da zona rural, em residências com conhecida infestação por triatomíneos, 20,7% mostraram-se sorologicamente positivos [12]. 
Analisando os valores obtidos no ELISA das quatro amostras reagentes para anticorpos para Trypanosoma cruzi, é possível perceber a diferença de reatividade. Duas amostras revelaram absorbâncias de 0,411 e 0,795, bem próximas ao valor de cut off (0,303), mas já consideradas reagentes por estarem acima da zona indeterminada (10% em torno do cut off). As outras duas amostras apresentaram valores de absorbância bem superiores: 2,663 e 2,831, para um mesmo valor de cut off. É importante salientar que, para fins de diagnóstico, é indicada a análise das amostras pelo método de imunofluorescência indireta, considerado como referência para a Doença de Chagas.
	O conhecimento da infecção, ainda na infância é relevante, pois possibilita um acompanhamento da evolução da doença, já que o tratamento com as drogas disponíveis no mercado tem sido, em alguns casos, eficiente durante a fase aguda ou infecção recente [4,7]. Depois da doença no estado crônico, as conseqüências clínicas podem tornar-se irreversíveis, com problemas que podem interferir nas atividades diárias durante toda a vida do indivíduo.

4. CONCLUSÕES

	A infecção por T. cruzi ocorre em crianças, já que está presente na amostra estudada, indicando a necessidade de maiores investigações e cuidados com a Doença de Chagas em áreas endêmicas.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BARUFFA, G. & ALCANTARA FILHO, A. Inquérito sorológico e entomológico da infecção pelo T. cruzi na região sul do Rio grande do Sul, Brasil. Ann. Soc. Belge. Med. Trop. 65 suppl. 1, 1985.p. 115-118. 

[2] BONAMETTI, A. M. et al. Seroprevalence of Trypanosoma cruzi Infection in Students at the Seven-Fourteen Age Range, Londrina, PR, Brazil, in 1995. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. vol. 93, no.6, 1998. p.727-732.

[3] CARVALHO, M.E. et al. Soroprevalência de infecção chagásica em área de Triatoma infestans após medidas de controle. Rev. Saúde Pública. vol. 34, no.1, 2000. p.15-20. 

[4] COURA, J.R. A Critical Review on Chagas Disease Chemotherapy, Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2002 97:3-24, 

[5] LANA, M. de & TARUFI, W.L. Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. In: NEVES, D.P. et al. Parasitologia Humana. 10 ed.: Atheneu, 2000. p.73-96.

[6] MONTOYA, R.; DIAS, J.C.P. e COURA. J.R. Doença de Chagas em uma comunidade do Sudeste do Brasil: I. Seguimento sorológico em uma área com controle vetorial. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, vol.45, no.5, 2003. p.269-274.

[7] NEVES, D.P. Parasitologia Dinâmica. São Paulo: Atheneu, 2003. Cap. 19: Doença de Chagas. p. 113-133.

[8] OLIVEIRA E SILVA, J.C.V. et al. Inquérito Sorológico em Escolares dos Municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha, MG, após a Implantação do Sistema de Vigilância Epidemiológica. In: XII SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO. Anais... 2004..

[9] REY, L. Bases da Parasitologia Médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. Cap. 3: Tripanossomíase por Trypanosoma cruzi: Doença de Chagas, p. 27-41.

[10] SANTA CATARINA. Secretaria de Estado da Saúde. Nota de informação. 31 mar. 2005.

[11] SESSA, Paulo Augusto et al. Soroprevalência da Doença de Chagas em crianças em idade escolar do Estado do Espírito Santo, Brasil, em 1999-2000. Cad. Saúde Pública 2002, v.18 n.6. p. 1756-1769.

[12] SOLIS COSTA, H. M.; FERREIRA, C. S. e CARVALHO, M. E. de. Human infection with Trypanosoma cruzi in Nasca, Peru: A seroepidemiological survey (1). Rev. Inst. Med. Trop. vol.39, no.2, São Paulo, 1997. p.107-112.

[13] UMEZAWA, E.S. & SILVEIRA, J.F. da. Serological diagnosis of Chagas Disease With Purified and defined Trypanosoma cruzi Antigens. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Vol. 94, suppl 1, 1999. p. 285-288.