PERFIL EM SDS-PAGE DAS PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL DE JUNDIÁ (Rhamdia quelen)

CAMPOS, Vinicius Farias1, 4; CAVALCANTI, Paulo Varoni1,4; SEIXAS, Fabiana Kömmling2,4; DELLAGOSTIN, Odir A.2,4; DESCHAMPS, João Carlos3,4; MOREIRA, Heden L. Marques1,4; COLLARES, Tiago1,4.

1- Laboratório de Engenharia Genética – LEGA
2- Laboratório de Biologia Molecular
3- Laboratório de Reprodução Animal
4- Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas 
Cenbiot – Campus Universitário s/n Caixa Postal 354 – CEP 96010-900/RS
E-mail: vcampos_ib@ufpel.edu.br
Web: www.ufpel.edu.br/lega

1. INTRODUÇÃO

	O plasma seminal é constituído por uma complexa mistura de proteínas e outras moléculas, no entanto, muitas ainda têm sua função desconhecida. Alguns polipeptídeos já foram caracterizados em outros animais, mas em jundiás não há estudos deste tipo. De acordo com [8], as proteínas são o maior constituinte	 orgânico do fluído seminal em peixes teleósteos, ocorrendo em concentrações de aproximadamente 100-300 mg/100ml de plasma.  O sêmen dos peixes tem uma composição única, contendo substâncias que dão suporte aos espermatozóides, mantendo a capacidade de fertilização, a motilidade e a viabilidade do espermatozóide [10]. Em outras espécies, como suínos e carneiros, alguns elementos iônicos e outros, como proteínas são os constituintes mais importantes do fluído seminal, onde têm por função manter a viabilidade de células gaméticas desses reprodutores [1]. 
A identificação dos vários grupos protéicos presentes no sêmen de muitas espécies pode dar suporte a diversas linhas de pesquisas: na criopreservação de gametas, determinando marcadores de congelabilidade, no melhoramento de técnicas de fertilização artificial, caracterizando proteínas específicas de cada espécie envolvidas na atividade espermática, e por conseqüência, potencializando técnicas de geração de animais transgênicos em massa, como SMGT (Sperm-Mediated Gene Transfer). O SMGT já foi demonstrado em jundiás por [2] com resultados satisfatórios. Outra utilização da caracterização desses polipeptídeos seria na contribuição para o desenvolvimento de peixes biorreatores de expressão seminal. 
O jundiá (Rhamdia quelen), espécie nativa do sul do Brasil, pertencente à família Pimelodidae, torna-se um interessante modelo biológico para a expressão de proteínas recombinantes no sêmen devido ao abundante volume seminal e ao baixo custo de criação dentro dos parâmetros da aqüicultura. Um dos primeiros passos e mais importantes para estabelecer o conhecimento de promotores gênicos que estão sendo expressos no biorreator candidato, é a análise das proteínas naturais existentes no fluido seminal, resultantes desta expressão gênica. Neste sentido, o projeto no qual este estudo faz parte, tem por objetivo identificar proteínas conservadas a todos os indivíduos da espécie, para futuramente identificar o gene responsável pela expressão e sua região regulatória. Na maioria destas pesquisas o método empregado com alta eficiência na separação e evidenciação dos diversos polipeptídeos é a eletroforese [4]. Muitas proteínas do plasma seminal de várias espécies têm sido analisadas através do SDS-PAGE [7], [5], [3]. O objetivo do presente estudo foi de caracterizar de uma forma ampla as proteínas do plasma seminal de jundiá (Rhamdia quelen) através da eletroforese do tipo SDS-PAGE, buscando principalmente grupo de proteínas conservadas a todos os indivíduos da espécie para, em estudos posteriores, identificar um desses polipeptídeos que seja expresso apenas no fluido seminal e através de técnicas de biologia molecular buscar o promotor gênico que dirige a expressão desta proteína ao líquido seminal para a geração de um animal transgênico biorreator. 

2. MATERIAL E MÉTODOS

	Neste estudo foram utilizados 22 animais cultivados da estação de Piscicultura da Barragem do Chasqueiro da UFPel e 6 peixes selvagens capturados no Arroio São Gonçalo em Pelotas, RS. Foi coletado por massagem abdominal, para excitação das gônadas, de 6 a10ml de sêmen de cada  animal,  com cuidado para se evitar a contaminação com as fezes e a urina,  as quais podem ativar os espermatozóides. Obteve-se o plasma seminal por centrifugação do sêmen a 8000g a 4°C por 10minutos. Cada amostra foi preparada com alíquotas de 50µl plasma e 10µl de tampão de amostra, após foram submetidas à fervura por 10minutos. De acordo com [6] a eletroforese do tipo SDS-PAGE foi feita pelo método vertical com o sistema BIO-RAD Mini-Protean 3 Cell® e em cuba vertical de eletroforese em gel de poliacrilamida de20x20cm. Foram feitas corridas com géis concentrados a 12% e a 8% com uma voltagem de 140 V por uma hora e meia. Como padrão foi utilizado o marcador molecular BenchMark Protein Ladder™.  Os géis foram corados a temperatura ambiente com Coomassie Brilliant Blue em ‘over-night’. O processo de descoramento dos géis foi realizado em solução descorante por 2 horas em banho-maria a uma temperatura de 75°C.  A análise dos zimogramas foi baseada na clara visualização e distinção das bandas protéicas formadas durante a eletroforese. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

	A distribuição das bandas de proteínas no plasma seminal pode ser vista na Figura 1. Sete bandas foram identificadas: 8kDa; 13,5kDa; 23kDa; 26kDa; 35kDa; 66kDa; 80kDa. Outras bandas foram visualizadas com uma menor definição. Destas bandas apenas duas (26kDa e 80kDa) se mostraram conservadas a todos os machos analisados. A banda de 80kDa mostrou uma alta concentração de polipeptídeos, sendo bem mais concentrada que as demais. A banda de 26 kDa demonstrou-se presente em todos os machos analisados. As outras bandas citadas acima tiveram uma distribuição variável entre os animais, dando a possibilidade de serem estudadas como marcadores bioquímicos de fertilidade e congelabilidade do sêmen destes peixes, o que já foi estudado por [9] em eqüinos. 
	Os dados mais importantes encontrados neste estudo foi a presença de proteínas conservadas em todas as amostras de sêmen, o que abre um caminho para estudos posteriores de caracterização molecular para determinação do gene responsável por esta expressão e principalmente seu promotor. Outro estudo de caracterização molecular destas bandas de 26kDa e de 80kDa é o 2D-PAGE, onde será possível a separação de outras proteínas de mesmo peso molecular, o que possivelmente ocorre na banda de 80kDa, devido a sua alta concentração nos ejaculados em estudo. 
	                     
	 Figura 1. SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal de Jundiá (Rhamdia quelen) mostrando a distribuição das bandas de acordo com seu peso molecular. 

                       

4. CONCLUSÕES

	Através da caracterização em SDS-PAGE foi possível identificar proteínas conservadas a todos os ejaculados dos exemplares analisados, possibilitando que estudos de manipulação gênica sejam realizados para a caracterização dos genes e promotores envolvidos nessa expressão em relação as principais proteínas conservadas, bem como nos grupos protéicos de maior expressão. A  família protéica eleita para estudos posteriores é a de 80 Kda, devido a alta concentração e conservação em todas as amostras avaliadas.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] CATT, S. L., O’BRIEN, J. K., MAXWELL, W.M.C., EVANS, G. Assessment of ram and boar spermatozoa during cell-sorting by flow cytometry. Reproduction Domestic Animal, 1997, 32, p. 463-473.

[2] COLLARES, T. TRANSFERÊNCIA GÊNICA MEDIADA POR ESPERMATOZÓIDES PARA GERAÇÃO DE JUNDIÁS (Rhamdia quelen) TRANSGÊNICOS. Pelotas. 2004. 40p. Dissertação de Mestrado. Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. 

[3] FRAZER, G. S., BUCCI, D. M. SDS–PAGE characterization of the proteins in equine seminal plasma. Theriogenology, 1996, 46, p.579-591.

[4] JOBIM, M. I. M., OBERST, E.R., SALBEGO, C.G., SOUZA, D.O., WALD, V.B., TRAMONTINA, F., MATTOS, R.C. Two-dimensional poliacrilamide gel electrophoresis of bovine seminal plasma proteins and their relation with the freezability. Theriogenology, 2004, 61, p. 255-266.

[5] KOWALSKI, R., GLOGOWSKI, J., KUCHARCZYK, D., GORYCZKO, K., DOBOSZ, S., CIERESZCO, A. Proteolytic activity and eletrophoretic profiles pf proteases from seminal plasma of teleosts. Journal of Fish Biology, 2003, 63, p. 1008-1019.

[6] LAEMMILI U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature, 1970, 5, p. 677-680.

[7] LAHNSTEINER, F., MANSOUR, N., BERGER, B., Seminal plasma proteins prolong the viability of rainbow trout (Oncorynchus mykiss) spermatozoa. Theriogenology, 2004, 62, p. 801-808.

[8] LOIR M, LABBE C, MAISSE G, PINSON A, BOULARD G, MOUROT B, et al. Proteins of seminal fluid and spermatozoa  of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): partial characterization and variations. Fish of Fhysiology and Biochemestry, 1990, 8, p.485-495.

[9] RONCOLETTA, M., FRANCESCHINI, P. H., LIMA, V. F. M. H., RODRIGUES L. H., OLIVEIRA, M. A., SILVA, C. Perfil em SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal e sua relação com a congelabilidade do sêmen de touros doadores da raça gir. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, 1999, 36, n° 2.
[10] WOJTCZAK, M., DIETRICH, G. J., CIERESZKO, A. Transferrin and antiproteinases are major proteins of common carp seminal plasma. Fish and Shellfish Immunology, 2005, 19, p. 387-391.