Title: cccccc
Author: CÄNDIDA DE FARIAS
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INOCULAÇÃO ARTIFICIAL DE Colletotrichum gloeosporioides EM SEMENTES DECEBOLA EM DIFERENTES NIVEIS DE RESTRIÇÃO HÍDRICA

BERTONCELLO, Mirela Rossetto^1; FARIAS, Cândida Renata Jacobsen de^1; CORRÊA, Carla Lima^2; PIEROBOM, Carlos Roberto^1.

^1 Laboratório de Patologia de Sementes – DFs. - FAEM/ UFPel
^2Laboratório de Tecnologia de Sementes – DFt. - FAEM/ UFPel
^1mirossetto@yahoo.com.br

1.	INTRODUÇÃO

Na área de patologia de sementes, tem sido crescente o interesse pela utilização da técnica de restrição hídrica, seja em meio de cultura agarizado ou substrato papel, com o objetivo de inibir ou retardar a germinação das sementes, facilitando as operações de avaliações de flora fúngica em testes de sanidade [5]. Baseado no princípio de controle de germinação, a metodologia também tem sido empregada na promoção de infecção de sementes com fungos fitopatogênicos, visando a estudos epidemiológicos [9].
O estresse hídrico induzido em diferentes tipos de substratos é um fator que tem influenciado o comportamento de crescimento de fungos [3]. Segundo [4], o estresse hídrico é um do fator condicionante do processo de penetração do inoculo em tecidos vegetais suscetíveis, sugerindo que o conhecimento das exigências hídricas dos fungos pode fornecer subsídios para as medidas de controle de doenças.
O potencial hídrico é a diferença entre o potencial químico da água em um sistema, ou parte do sistema, e o potencial químico da água livre, em condições iguais da pressão atmosférica e temperatura [6]. Este potencial é reduzido pela adição de substâncias polares, e, ou, íons no meio, já que as moléculas bipolares da água são atraídas e retidas por este solutos, reduzindo um decréscimo na atividade da água [7]. Neste sentido, a indução da restrição hídrica e normalmente feita através da adição de solutos osmoticamente ativos como CaCl2, KCl, NaCl, manitol, sacarose ou de politileno glicol.
Alguns estudos evidenciaram que os fungos apresentam comportamento alterado em relação ao estresse hídrico induzidos em diferentes substratos de cultivo, tal como foi observado em Botrytis cinérea e Alternaria alternata [2]; Phytophtora cinnamomi e Alternaria tenuis [1]; Fusarium roseum [12]; Fusarium moniliforme [11] e Cryphonectria parasítica [8].
Dessa forma, o presente trabalho objetivou avaliar a influência da restrição hídrica em substrato agarazido na inoculação de sementes de cebola com fungo Collettotrichum gloesporoides, importante patógeno da cultura, agente causal da doença conhecida tradicionalmente como “mal das sete voltas”.   

2. MATERIAL E METODO

O experimento foi conduzido no Laboratório de Patologia de Sementes do Departamento de Fitossanidade da FAEM/UFPel. As sementes de cebolas utilizadas nesse trabalho foram da cultivar Crioula, provenientes do município de Herval/RS. 
Para inoculação de Colletotrichum gloeosporioides, em sementes de cebola, por meio da restrição hídrica utilizou-se placas de Petri de 9cm de diâmetro contendo 25 ml de meio BDA (batata-dextrose-agar) modificado osmoticamte com restritor sacarose e NaCl nas concentrações de -0,4; -0,6; -0,8 e -1,0MPa (calculado através do Software SPPM)  e como testemunha BDA básico (sem restrição). Sobre o meio foi adicionada solução de esporos do fungo, sendo as placas incubadas por 5 dias em câmara de crescimento regulada à temperatura de 25 ± 2ºC e fotoperíodo de 12 horas luz. Após o crescimento micelial, as sementes foram colocadas sobre as colônias de C. gloeosporioides e novamente incubadas nas mesmas condições, permanecendo por um período de 24, 48 e 72h. Após a inoculação as sementes foram submetidas à secagem em estufa com circulação de ar forçado (25ºC, por 48 horas).
 Posteriormente a secagem as sementes foram submetidas ao teste do papel filtro conforme descrito por [6]. O substrato utilizado foi papel mata borrão, umedecido com água destilada, colocando-se três folhas por caixa gerbox (caixa plástica, medindo 11x11x3cm, com tampa ). Após as sementes foram colocadas em uma sala de incubação por um período de 7 dias á temperatura de 25°C e fotoperíodo de 12 horas de luz. Após o período de incubação as sementes foram individualmente analisadas com auxilio de microscópio esteroscópico, observando-se então, a porcentagem de sementes infectadas pelo fungo. 

3.	RESULTADO E DISCUSSÃO

Através dos resultados obtidos (tabela 1) verifica-se que a adição de sacarose ao meio de cultura BDA aumenta a porcentagem sementes infectadas pelo fungo, aumentando de acordo com a maior disponibilidade de açúcar, uma hipótese do efeito estimulador no crescimento fúngico, até determinados potenciais hídricos negativos, pode estar associado a absorção desse soluto e do melhor ajuste  osmótico das células fúngicas, proporcionando maior turgor para a extensão celular. Entretanto, o mesmo não ocorre com a adição de NaCl, ao meio, pois a taxa de infecção é menor que a testemunha, BDA sem restrição, e a porcentagem de sementes infectadas diminui com a maior disponibilidade de sal, no entanto esse resultado concorda com os obtidos por [10] em estudos com Ascochyta paspali , essa teve seu crescimento reduzido a partir de potenciais osmóticos de -1,2 Mpa induzido com sal, acredita-se que níveis maiores de sal possam ser tóxicos ao fungo. Em relação ao tempo de inoculação observa-se que o período de 48 horas promoveu o maior número de sementes infectadas, quando comparado com os demais. 

Tabela 1 – Porcentagem de sementes de cebola infectadas com C.gloeosporioides após inoculação em diferentes tempos e níveis de potencial osmótico. Pelotas, 2005.
Tratamentos | | Período de incubação
| Níveis de restrição | 24 horas | 48 horas | 72 horas
| | | % SI | % SI | % SI
Com restrição | | - 0,4 | 17,75 | 31 | 34,25
| BDA + Sacarose | -0,6 | 20,50 | 38,75 | 37
| | -0,8 | 27,75 | 48 | 42,25
| | -1,0 | 38,75 | 65,75 | 55,50
| | -0,4 | 3,50 | 15,50 | 10,75
| | -0,6 | 3,00 | 13,50 | 10,00
| BDA + NaCl | -0,8 | 3, 25 | 11,50 | 9,75
| | -1,0 | 2,25 | 6,75 | 7,75
Sem restrição | BDA | 0,0 | 4,0 | 16,50 | 10,75

4.CONCLUSÃO

Através desses resultados verifica-se que a adição de solutos ao meio de cultura favorece a infecção das sementes por C. gloeosporioides, até determinados níveis de restrição, de acordo com o soluto utilizado. Sendo a técnica da restrição hídrica eficiente para obtenção de lotes com alto nível infecção. Trabalhos de epidemiologia, treinamento de analistas de sementes, entre outros dependem de lotes de sementes infectadas.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] ADEBAYO, A.A; HARRIS, R.F. Fungal growth responses to osmotic as compared to matric water potential. Soil Science America Proceedings, v.35, n.3, p.465-469, 1971.
[2] ALAM, S., JOYCE, D., WEARING, A. Effects of equilibrium relative humidity on in vitro growth of Botrytis cinerea and Alternaria alternata. Australian Journal of Experimental Agriculture, East Melbourne, v.36, n.3., p.383-388, 1996.
[3] COOK, R.J., PAPENDICK, R.I. Influence of water potential of soils and 3555 plants on disease. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v.10, n.1, p. 349-374, 1972.
[4] COOK, R.J., PAPENDICK, R.I. Role of potential in microbial growth and development of diesease, with special reference to postharvest pathology. HortScience, Alexandria, v.13, n. 5, p. 559-564,1979
[5] COUTINHO,W.M.; MACHADO,J.C.;VIEIRA,M.G.C. Uso da técnica da restrição      hídrica na inibição ou retardamento da germinação de sementes de arroz e feijão submetidas ao teste de sanidade em meio ágar-água. Revista Brasileira de Sementes, v.23,n.2, p.127-135, 2001.
[6] DUNIWAY, J.M. Water relations of water molds. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v.17, n.1, p. 431-460, 1979.
[7] FERREIRA, L.G.R. Fisiologia vegetal: relações hídricas. Fortaleza, Edições Universidade Federal do Ceará, 1988. 137p.
[8] GAO, S.; SHAIN, L. Effect of potential on virulent and hypovirulent strins of the chestnut blight fungus. Canadian Journal of Forest Research. Ottawa, v.25, n.6, p. 1024-1029, 1995. 
[9] MACHADO, J.C.; OLIVEIRA, J.A.; VIEIRA, M.G.G.C. Uso da restrição hídrica na inoculação de fungos em sementes de milho. Revista Brasileira de Sementes, v.23, n.2, p.88-94, 2001. 
[10] MORLEY, T.B.; WILLIAMS,B.L.;PRICE,T.V. The effects of water stress on the incidence and severity of paspalum leaf blight and on Ascochyta paspali. Australasian Plant Pathology, v.22, n.3, p.105-110, 1993. 
[11] SUBBARAO, K.V.; MICHALIDES, T.J.; MORGAN, D.P.Effects of osmotic potential and temperature on growth of two pathogens of figs and a biocontrol agent. Phytopathology, v. 83, n.12, p.1454-1459, 1993.
[12] WEARING.A . H; BURESS, L. W. Water potential and the saprophytic growth of Fusarium roseum “ graminearum”. Soil Biology Biochemisry, Oxford, v. 11, p. 661-667,1979.