MULTIPLEX PCR PARA IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus, S. hyicus e S. intermedius

PALUDO, Bianca4; GANDRA1,2; Eliezer Ávila; FERNANDEZ3, Maria Aparecida; SILVA1, Wladimir Padilha da.

1 Laboratório de Microbiologia de Alimentos, Dep. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial (DCTA),Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), Pelotas/RS. E-mail: silvawp@ufpel.tche.br.
2 Centro de Tecnologia, Universidade Estadual de Maringá (UEM), Umuarama/PR. 
3 Lab. Organização Funcional do Núcleo, Dep. de Biologia Celular e Genética, UEM, Maringá/PR.
4Bolsista de Iniciação Científica da FAPERGS

INTRODUÇÃO
O gênero Staphylococcus compõe-se de 38 espécies e 24 subespécies [1], das quais, apenas as espécies S. aureus, S. hyicus e S. intermedius (pertencentes ao grupo dos estafilococos coagulase positiva – ECP) foram associadas a surtos de intoxicação alimentar [2]. Essas três espécies apresentam características morfológicas semelhantes em meios seletivos e diferenciais utilizados na rotina laboratorial [2]. Além disso, os testes da coagulase e da termonuclease, freqüentemente utilizados para a identificação de espécies de estafilococos, podem não ser suficientes, nem para identificar e diferenciar as três espécies, nem para assegurar que esses microrganismos estejam ou não presentes em alimentos [2].
Uma das técnicas que vem sendo utilizada de maneira crescente para identificação bacteriana é o Multiplex PCR (MPCR), o qual utiliza mais de um par de primers na mesma reação possibilitando a amplificação simultânea de várias seqüências de DNA. Essa técnica possibilita a identificação de mais de uma espécie bacteriana na mesma reação PCR, promovendo uma avaliação mais ampla e rápida da presença de bactérias patogênicas em alimentos [6]. Na busca de métodos eficazes para detecção e identificação de patógenos alimentares, propõe-se a avaliação do limite de detecção de um MPCR baseado o gene nuc, para a identificação de três espécies de ECP (S. aureus, S. hyicus e S. intermedius). 
 
MATERIAL E MÉTODOS
Cepas Bacterianas
Utilizaram-se cepas das espécies Staphylococcus aureus, S. hyicus, S. intermedius e, como controle negativo. Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes e Escherichia coli.
Extração de DNA 
A extração do DNA genômico foi realizada de acordo com Matthews et al. [3], em Brain Heart Infusion (BHI, Oxoid) em 5 diluições seriadas (5.10, 102, 103, 104 e 105 UFC.mL-1).
Desenho dos primers 
Os primers foram baseados em seqüências completas do gene nuc, específicas para cada uma das três espécies de ECP, obtidas no GenBank/NCBI (número de acesso  NC_002745 para S. aureus, L23973 para S. hyicus e X67678 para S. intermedius). As seqüências selecionadas foram alinhadas entre si, utilizando-se o software Blast/GenBank/NCBI para verificar a existência de regiões homólogas entre os genes nuc nas três espécies. Levou-se em consideração que os primers anelassem nas regiões não homólogas, de forma a possibilitar amplificações espécie-específicas (Tabela 1).

Tabela 1 - Oligonucleotídeos utilizados para identificação de S. aureus, S. intermedius e S. hyicus, produtos de MPCR e espécies alvo

Primer	
Seqüência 5´- 3´	Produto de amplificação (pb)	
Espécie	
NUC1	ATGAAGTCAAATAAATCGCT	458	S. aureus	
NUC2	TTTGGTGAAAAATACTTCTC			
NUC3	AAAAATAACAACAGGATTGA	270	S. hyicus	
NUC4	GTAAAGTCTGAAGCTTCTTT			
NUC5	GAAAAAAATTACAACAGGCG	106	S. intermedius	
NUC6	CACATCCGTTGAAGACTTTT			

Multiplex PCR
As reações continham 1L das diluições 5.10, 102, 103, 104 e 105 UFC.mL-1 de DNA.  Foram adicionados 1M de cada primer (Tabela 1) em todas as reações (MPCR), 200 M de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP, Invitrogen), 1U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, 5U.L-1), 2,0mM de MgCl2  (Invitrogen) e 4L de tampão 10 X (Invitrogen), perfazendo um volume total de 40 L. O programa de amplificação consistiu de 2 min a 94C, 2 min a 55C e 3 min a 72C, por 40 ciclos, utilizando um termociclador PTC 100 (MJ Research). Os produtos da amplificação foram analisados em gel de agarose 1% (p/v), corado com 0,5g.mL-1 de brometo de etídio. Todas as cepas foram amplificadas três vezes, com DNA extraído em dias diferentes. 

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Como pode ser verificado nas Figuras 1, 2 e 3 foi possível amplificar concentrações de DNA de até 102 UFC.mL-1 para as espécies S. aureus, S. hyicus e S. intermedius. Para essa última espécie houve amplificação em concentrações de DNA de até 5x10 UFC.mL-1, porém, de modo não reprodutível (Figura 3). Desse modo, o limite mínimo de detecção para todas as espécies foi de 102 UFC.mL-1.

Figura 1 - Produtos de mPCR com DNA extraído a partir de diluições seriadas de S. aureus. 1 - padrão de peso molecular (123 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2 - 105 UFC.mL-1; 3 - 104 UFC.mL-1; 4 - 103 UFC.mL-1; 5 - 102 UFCmL-1; 6 – 5x10 UFCmL-1; 7 - controle negativo 1 (E. coli), 8 -  controle negativo 2 (Listeria monocytogenes).

Figura 2 - Produtos de mPCR com DNA extraído a partir de diluições seriadas de S. hiycus. 1 - padrão de peso molecular (123 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2 - 105 UFC.mL-1; 3 - 104 UFC.mL-1; 4 - 103 UFC.mL-1; 5 - 102 UFC.mL-1; 6 – 5 x 10 UFC.mL-1, 7 - controle negativo 1 (E. coli), 8 -  controle negativo 2 (Listeria monocytogenes).

	

Figura 3 - Produtos de mPCR com DNA extraído a partir de diluições seriadas de S. intermedius. 1 - 105 UFC.mL-1; 2 - 104 UFC.mL-1; 3 - 103 UFC.mL-1; 4 - 102 UFC.mL-1; 5 – 5 x 10 UFCmL-1, 6 - controle negativo 1 (E. coli), 7 -  controle negativo 2 (Listeria monocytogenes), 8 - padrão de peso molecular (100bp DNA Ladder, Biolabs).

Outros autores também têm estudado o limite de detecção de MPCR, tanto para a identificação de estafilococos em culturas isoladas, quanto em alimentos. Tamarapu et al. [5] utilizaram seqüências dos genes nuc e entC para a identificação de cepas padrão de S. aureus em leite e derivados artificialmente contaminados, e também verificaram um limite de  detecção na faixa de 102 UFC.mL-1, entretanto, Wilson et al. [7], obtiveram como limite 105 UFC.mL-1. Essas diferenças na sensibilidade podem estar associadas à própria reação, pois pode ocorrer competição entre os pares de primers no MPCR, o que poderia contribuir efetivamente para a diminuição da sensibilidade. Adicionalmente, Tamarapu et al. [5] ressaltam que diferenças quanto a valores de sensibilidade encontrados em estudos com MPCR podem estar associados à pureza do DNA e a existência de inibidores enzimáticos.
A partir dos resultados obtidos verifica-se que o mPCR desenvolvido permitiu a identificação de S. aureus, S. intermedius e S. hyicus. Com relação à sensibilidade, observa-se que o limite de detecção alcançado (102 UFC.mL-1) foi aceitável  para identificação de ECP, pois, em alimentos nos quais esses patógenos representam perigo microbiológico, as legislações em geral estipulam como limite máximo permissível o valor 103 UFC.mL-1. Além disso, é importante ressaltar que a produção de enterotoxinas em ECP ocorre apenas quando esses microrganismos atingem contagens superiores a 105 UFC.g-1 de alimento.
A metodologia usual de identificação de S. aureus, S. hyicus e S. intermedius envolve a semeadura em meio seletivo-diferencial, seguida pela confirmação através do teste da coagulase, não sendo suficientemente discriminatória para essas 3 espécies de ECP. Essa diferenciação é particularmente importante em investigações epidemiológicas, pois esses microrganismos podem causar intoxicações alimentares. Dessa forma, o mPCR proposto, devido ao limite de detecção apresentado, pode ser utilizado na identificação das três espécies de ECP potencialmente capazes de causar intoxicação estafilocócica. 

CONCLUSÃO
O mPCR proposto, com seqüências do gene nuc, apresentou especificidade para identificação de S. aureus, S. intermedius e S. hyicus, com um limiar de detecção de 102 UFC.mL-1.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.	EUZÉBY, J. P. List of bacterial names with standing in nomenclature: a folder available on the Internet. International Journal of Systematic. Bacteriology, v. 47, p.590-592. 1997.
2.	KLOOS, W. E.; BANNERMAN, T. L. Staphylococcus and Micrococcus. In: MURRAY, P. R.; BARON, E. J.; PFALLER, M. A.; TENOVER, F. C.; YOLKEN, R. H. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology. 7th. Edition. 1999. Cap.16, p.264-282.
3.	MATTHEWS, K. R.; ROBERSON, J.; GILLESPIE, B. E.; LUTHER, D. A.; OLIVER, S. P. Identificação and differentiation of coagulase-negative Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. Journal of Food Protection, v.60, n.6, p. 686-688, 1997.
4.	SILVA, W. P.; SILVA, J. A.; MACEDO, M. R. P.; ARAÚJO, M. R.; MATA, M. M.; GANDRA, E. A. Identification of Staphylococcus aureus, S. intermedius, and S. hyicus by PCR amplification of coa and nuc genes. Brazilian Journal of Microbiology, v. 34 p. 125-127. 2003.
5.	TAMARAPU, S.; MCKILLIP, J. L.; DRAKE, M. Development of a multiplex polymerase chain reaction assay for detection and differentiation of Staphylococcus aureus in dairy products. Journal of Food Protection, v.64, n.5, p.664-668. 2001.
6.	TANG, Y.; PERSING, D. Molecular detection and identification of microorganisms. In: MURRAY, P. R.; BARON, E. J.; PFALLER, M. A.; TENOVER, F. C.; YOLKEN, R. H. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology. 7th. Edition. 1999. Cap.13, p.215-244.
7.	WILSON, I.G.; COOPER, J. E.; GILMOR, A. Detection of enterotoxigenic of Staphylococcus aureus in dried skimmed milk: use of polymerase chain reaction for amplification and detection of staphylococcal enterotoxin genes entB and entC1 and the thermonuclease gene nuc. Applied Environmental Microbiology, v. 57, p. 1793-1798. 1991.