mPCR COM SEQUENCIAS DO GENE nuc PARA IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA EM LEITE

TRINDADE1,4, Paula Santos; GANDRA1,2; Eliezer Avila,; FERNANDEZ3, Maria Aparecida; SILVA1Wladimir Padilha da.

1 Laboratório de Microbiologia de Alimentos, Dep. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial (DCTA),Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), Pelotas/RS. E-mail: silvawp@ufpel.tche.br.
2 Centro de Tecnologia, Universidade Estadual de Maringá (UEM), Umuarama/PR.
3 Lab. Organização Funcional do Núcleo, Dep. de Biologia Celular e Genética, UEM, Maringá/PR.
4 Bolsista de Iniciação Científica da FAPERGS
trindadeps@bol.com.br

INTRODUÇÃO
O gênero Staphylococcus é composto por 38 espécies e 24 subespécies [1], das quais, apenas as espécies S. aureus, S. hyicus e S. intermedius (pertencentes ao grupo dos estafilococos coagulase positiva – ECP) foram associadas a surtos de intoxicação alimentar [2]. Essas três espécies apresentam características morfológicas muito semelhantes, quando semeadas em meios seletivos e diferenciais comumente utilizados na rotina laboratorial [2]. Além disso, os testes da coagulase e da termonuclease, freqüentemente utilizados para a identificação de espécies de estafilococos, podem não ser suficientes, nem para identificar e diferenciar as três espécies, nem para assegurar que esses microrganismos estejam ou não presentes em alimentos [2].
Uma das técnicas que vem sendo utilizada de maneira crescente para identificação bacteriana é o Multiplex PCR (mPCR), o qual utiliza mais de um par de primers na mesma reação, amplificando,  simultaneamente, várias seqüências de DNA. Essa técnica possibilita a identificação de mais de uma espécie bacteriana na mesma reação PCR, promovendo uma avaliação mais ampla e rápida de bactérias patogênicas em alimentos [6]. Dessa forma, objetivou-se avaliar o limiar de detecção de um mPCR, com seqüências do gene nuc, para a identificação de três espécies de ECP (S. aureus, S. hyicus e S. intermedius) diretamente em leite bovino integral. 
 
MATERIAL E MÉTODOS
Cepas Bacterianas
Utilizaram-se cepas das espécies Staphylococcus aureus, S. hyicus, S. intermedius e, como controles negativos, cepas de Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes e Escherichia coli.
Extração de DNA 
A extração do DNA genômico no leite bovino integral artificialmente contaminado foi realizada de acordo com Meiri-Bendek et al. [4], a partir de cindo diluições seriadas (5.10, 102, 103, 104 e 105 UFC.mL-1) com culturas de Staphylococcus aureus, S. hyicus e S. intermedius.
Desenho dos primers 
Os primers foram desenhados com base em seqüências completas do gene nuc, específicas para cada uma das três espécies de ECP, obtidas no GenBank/NCBI (número de acesso  NC_002745 para S. aureus, L23973 para S. hyicus e X67678 para S. intermedius). As seqüências selecionadas foram alinhadas entre si, e com os genes de outras espécies bacterianas, utilizando-se o software Blast/GenBank/NCBI para verificar a existência de regiões homólogas entre os genes nuc nas três espécies. Levou-se em consideração que os primers anelassem nas regiões não homólogas, de forma a possibilitar amplificações espécie-específicas (Tabela 1).

Tabela 1 - Oligonucleotídeos utilizados para identificação de S. aureus, S. intermedius e S. hyicus, produtos de mPCR e espécies alvo

Primer	
Seqüência 5´- 3´	Produto de amplificação (pb)	
Espécie	
NUC1	ATGAAGTCAAATAAATCGCT	458	S. aureus	
NUC2	TTTGGTGAAAAATACTTCTC			
NUC3	AAAAATAACAACAGGATTGA	270	S. hyicus	
NUC4	GTAAAGTCTGAAGCTTCTTT			
NUC5	GAAAAAAATTACAACAGGCG	106	S. intermedius	
NUC6	CACATCCGTTGAAGACTTTT			

Multiplex PCR
As reações continham 1L das diluições 5.10, 102, 103, 104 e 105 UFC.mL-1 de DNA para a avaliação da sensibilidade.  Foram adicionados 1 M de cada primer (Tabela 1) em todas as reações (MPCR), 200 M de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP, Invitrogen), 1U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, 5U.L-1), 2,0 mM de MgCl2  (Invitrogen) e 4 L de tampão 10 X (Invitrogen), perfazendo um volume total de 40 L. O programa de amplificação consistiu de 2 min a 94C, 2 min a 55C e 3 min a 72C, por 40 ciclos, utilizando um termociclador PTC 100 (MJ Research). Os produtos da amplificação foram avaliados em gel de agarose 1% (p/v), corado com 0,5 g.mL-1 de brometo de etídio. Todas as cepas foram submetidas a três processos de amplificação, com DNA extraído em dias diferentes. 

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Verificou-se que os primers NUC1, NUC2, NUC3, NUC4, NUC5 e NUC6 foram específicos para os microrganismos alvo aos quais se destinavam, obtendo-se apenas a amplificação dos fragmentos estimados para cada espécie a partir de DNA extraído de leite artificialmente contaminado com a espécie alvo (Figura 1). 

Figura 1 - Produtos de mPCR obtidos com os primers NUC1-NUC2, NUC3-NUC4 e NUC5-NUC6, visualizados em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, sob luz ultravioleta.  1 – controle negativo 1 (E. coli); 2 - controle negativo 2 (Listeria monocytogenes ATCC 764); 3 – Produto de PCR obtido a partir de leite contaminado com isolado clínico de S. intermedius; 4 – Produto de PCR obtido a partir de leite contaminado com isolado clínico de S. hyicus;  5 - Produto de PCR obtido a partir de leite contaminado com S. aureus ATCC 29213; 6 - controle negativo 3 (E. coli); 7 -  controle negativo 4 (água destilada esterilizada); 8 -padrão de peso molecular (100bp DNA Ladder).

Nas amostras de leite contaminadas artificialmente com S. aureus, foi possível amplificar concentrações de DNA de até 102 UFCmL-1 (Figura 2). Já para S. hyicus e S. intermedius foram obtidas bandas nítidas e definidas apenas até 103 UFC.mL1 (Figuras 3 e 4). Para esses 2 últimos microrganismos, com 102UFC.mL-1 foram obtidas bandas fracas e pouco nítidas, não havendo, além disso, repetibilidade, por isso, é mais adequado aceitar  como limite de detecção a concentração microbiana de 103UFC.mL-1. 

Figura 2 - Produtos de mCR obtidos com DNA extraído de leite inoculado com diluições seriadas de S.aureus ATCC 29213 amplificado com os primers NUC1- NUC2, visualizados em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, sob luz ultravioleta. 1 - 104 UFC.mL-1; 2 - 103 UFCmL-1; 3 - 102 UFCmL-1; 4 - 50 UFC.mL-1; 5 - padrão de peso molecular (100bp DNA Ladder).

Figura 3: Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído de leite inoculado com diluições seriadas de isolado clínico de S. hiycus amplificado com os primers NUC3- NUC4, visualizados em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, sob luz ultravioleta. 1 - 104 UFC.mL-1; 2 - 103 UFCmL-1; 3 - 102 UFCmL-1; 4 - 50 UFCmL-1; 5 - padrão de peso molecular (100bp DNA Ladder).

Figura 4: Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído de leite inoculado com diluições seriadas de isolado clínico de S. intermedius amplificado com os primers NUC5- NUC6, visualizados em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, sob luz ultravioleta. 1 - 105 UFC.mL-1; 2 - 104 UFC.mL-1; 3 - 103 UFCmL-1; 4 - 102 UFCmL-1; 5 - 50 UFCmL-1; 6 - controle negativo 1 (E. coli); 7 -  controle negativo 2 (Listeria monocytogenes ATCC 764); 8 - padrão de peso molecular (100bp DNA Ladder).

Tamarapu et al. [5] utilizando um mPCR para os genes nuc e entC em cepas padrão de S. aureus diretamente em leite e queijo cheddar artificialmente contaminados, também obtiveram um limiar de  detecção na faixa de 102 UFC.mL-1. Limites menos efetivos foram verificados por Wilson et al. [6] em um estudo similar ao de Tamarapu et al. [5] os quais obtiveram 105 UFC.mL-1 como limite mínimo de detecção.
A partir dos resultados obtidos é possível inferir que o mPCR com o conjunto de primers propostos apresenta sensibilidade aceitável para a detecção de ECP em alimentos, levando-se em consideração que o limiar de detecção verificado foi de 103 UFC.mL-1. Deve-se considerar que o número mínimo de ECP capaz de produzir enterotoxinas em quantidade suficiente para causar intoxicação alimentar é de aproximadamente 106 UFC [5]. Além disso, para a maioria dos alimentos, as legislações em vigor no Brasil exigem como limite permissível o valor 103 UFC.mL-1 (RDC n°12, Brasil 2001) para os ECP, fato que reitera a adequação do limite de detecção verificado. 

CONCLUSÃO
Os primers NUC1 e 2, NUC 3 e 4 e NUC 5 e 6 apresentaram especificidade para identificar S. aureus, S. intermedius e S. hyicus, com um limite de detecção em leite, de 103 UFC.mL-1. 

AGRADECIMENTO
	À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), pela concessão da bolsa de estudo. 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1]	EUZÉBY, J. P. List of bacterial names with standing in nomenclature: a folder available on the Internet. Int. J. Syst. Bacteriol., v. 47, p.590-592. 1997.
[2]	KLOOS, W. E.; BANNERMAN, T. L. Staphylococcus and Micrococcus. In: MURRAY, P. R.; BARON, E. J.; PFALLER, M. A.; TENOVER, F. C.; YOLKEN, R. H. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology. 7th. Edition. 1999. Cap.16, p.264-282.
[3]	MATTHEWS, K. R.; ROBERSON, J.; GILLESPIE, B. E.; LUTHER, D. A.; OLIVER, S. P. Identificação and differentiation of coagulase-negative Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. J. Food Prot., v.60, n.6, p. 686-688, 1997.
[4]	MEIRI-BENDEK, I.; LIPKIN, E.; FRIEDMANN, A.; LEITNER, G.; SARAN, A.; FRIEDMAN, S.; KASHI, Y. A PCR-based method for the detection of Streptococcus agalactiae in milk. J. Dairy Sci., v.85, p.1717-1723. 2002.
[5]	TAMARAPU, S.; MCKILLIP, J. L.; DRAKE, M. Development of a multiplex polymerase chain reaction assay for detection and differentiation of Staphylococcus aureus in dairy products. Journal of Food Protection, v.64, n.5, p.664-668. 2001.
[6]	WILSON, I.G.; COOPER, J. E.; GILMOR, A. Detection of enterotoxigenic of Staphylococcus aureus in dried skimmed milk: use of polymerase chain reaction for amplification and detection of staphylococcal enterotoxin genes entB and entC1 and the thermonuclease gene nuc. Appl. Environ. Microbiol. v. 57, p. 1793-1798. 1991.