AVALIAÇÃO DE DIFERENTES EXTRATOS DA PLANTA Origanum vulgare L. FRENTE À Malassezia pachydermatis*.

PRESTES, L. S.1; SANTIN, R.2 SANTOS, M.A.Z.3; SCHRAMM, R.C.4; RODRIGUES, M.A.R5.; SCHUCH, L.F.D.6; MEIRELES, M.C.A.7

1Mestranda do PPG em veterinária – Fvet/UFPel
2Bolsista de iniciação científica CNPq – (LDI) – DVP/FVet/UFPel
3Laboratório de Química Orgânica – DQO/IQG/UFPel
4Laboratório de Doenças Infecciosas (LDI) - DVP/FVet/UFPel
5Laboratório de Química Orgânica – DQO/IQG/UFPel
6Laboratório de Doenças Infecciosa – DVP/FVet/UFPel
7Laboratório de Doenças Infecciosa – DVP/FVet/UFPel, Campus universitário s/n, CEP 96010900.

1.	INTRODUÇÃO

		O uso de plantas medicinais no tratamento de enfermidades acompanha a história da humanidade. Os primeiros povos que escreveram obras sobre medicina e plantas medicinais foram os chineses e egípcios. Hipócrates utilizou e catalogou centenas de drogas de origem vegetal. Em países do terceiro mundo, incluindo o Brasil, onde 70-80% da população não tem assistência farmacêutica, as plantas medicinais são utilizadas como alternativa terapêutica [3].
		O crescimento do mercado de medicamentos fitoterápicos no Brasil é de 15% ao ano, já o mercado de medicamentos sintéticos é de 3-4%, sendo que apenas 20% da população consomem 63% dos medicamentos sintéticos e o restante da população utiliza os produtos de origem vegetal como recurso terapêutico [14].
		A etnoveterinária tem como um de seus objetivos validar os conhecimentos de diversas comunidades na utilização de medicamentos elaborados a partir de plantas medicinais, principalmente em países em desenvolvimento, que necessitam de alternativas economicamente viáveis visando o bem estar animal[10].Este trabalho se propõe ao estudo dos extratos do orégano, planta que é utilizada tradicionalmente como tempero[15]. O gênero Origanum baseado em seus aspectos morfológicos se divide em três grupos, dez divisões, 38 espécies, seis subespécies 17 híbridos distribuídos ao longo do mediterrâneo [15]. Análises químicas do óleo do orégano mostram seus principais componentes, o thymol e  o carvacrol [1,2].
		A otite externa em pequenos animais é a doença mais comum diagnosticada em cães e, portanto é marcante a sua importância na clínica [4,13]. A Malassezia pachydermatis é encontrada em otite externa como agente perpetuante, facilitada pela utilização excessiva de antibacterianos que eliminam bactérias comensais competidoras [8]. Segundo Eichenberg (2003), a resistência às drogas antifúngicas se deve ao uso indiscriminado destes medicamentos e ainda destaca a necessidade de estudos sobre a suscetibilidade da M. pachydermatis frente às drogas existentes no mercado. O uso de fitoterápicos pode fazer frente a esses problemas.
		O presente trabalho objetiva avaliar a ação de diferentes procedimentos de extração de O. vulgare sobre M. pachydermatis “in vitro”.

2.	MATERIAIS E MÉTODOS

		Obteve-se amostra seca de Origanum vulgare L., com respectivo laudo de caracterização e identificação botânica da planta, cultivo e secagem. Foram preparados três extratos sendo eles, um extrato oleoso, um decocto e um extrato fluído.
		 A extração do óleo essencial foi realizada através de arraste de vapor utilizando Clevenger modificado a partir de 100g da amostra da planta. Análise através de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM) foi realizada.
Na preparação do extrato fluído, foram utilizados 50g da amostra de plantas em 500ml de álcool de cereais a 70°, preparadas por maceração em temperatura ambiente durante 20 dias, sofrendo agitação diária. Após, o álcool foi extraído utilizando-se um rotavapor, á 550C, conectado a bomba de vácuo à 600 mmHg de pressão. O decocto foi preparado utilizando-se 2g de planta seca em 50ml de água destilada estéril, permanecendo em ebulição durante 15 minutos. Nesses dois métodos, o volume inicial foi reposto com água destilada estéril. 
		Os isolados de Malassezia pachydermatis foram obtidos através da coleta de material do meato acústico externo de cães com otite externa clínica utilizando-se zaragatoas estéreis e feita a semeadura em meio Mycosel®, cultivadas em estufa a temperatura de 35°C. Após 72hs foi observado crescimento das colônias realizado exame microscópico para identificação das leveduras.
		O efeito antimicrobiano dos extratos foi analisado através do método de Microdiluição em Caldo de acordo com a NCCLS de 1997[12], modificado por Nascente [11]. Os extratos foram diluídos em base logarítmica dois, colocados no volume de 100µl em um orifício de uma microplaca de fundo plano com 96 orifícios, acrescentados de 100µl do inoculo e incubados a temperatura de 35°C, sob agitação de 100 rpm/minuto. O inoculo foi preparado a partir de cada das 4 amostras de M. pachydermatis a testar, ajustada a escala 0,5 de McFarland.
O crescimento microbiano foi avaliado por turvação comparada a padrões postitivo e negativo de crescimento fúngico. Considerou-se como concentração inibitória mínima (CIM) a recíproca da diluição do extrato onde não houve crescimento visível.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

		A análise cromatográfica do óleo essencial demonstrou padrões compatíveis com o esperado para O. vulgare, com a presença dos principais constituintes – timol e carvacrol.
		O CIM médio para os três extratos são apresentados na TABELA 1. Observa-se um forte efeito inibidor do óleo essencial, com CIM de 0,25%. O extrato fluído apresentou CIM de 6,5% e o decocto 25%.
		O óleo de Origanum vulgare foi testado frente a fungos como a Candida albicans [7,9] e Penicilium digitatum [5],com resultados positivos.
		Outro aspecto a ressaltar é a relação quantidade de planta utilizada para preparação do extrato e CIM obtido. Na obtenção do óleo essencial, utilizou-se 100g de planta para obter 1,4 ml de óleo essencial, enquanto que na preparação do extrato fluido, com 50g obtivemos 500ml de extrato. Ao relacionarmos com o CIM desses extratos, sugere que o rendimento de 1g de planta preparada pelo método do extrato fluido apresenta maior efeito antifúngico do que uma grama submetida a extração de óleo essencial.
		Este fator poderia ser explicado por uma maior extração dos constituintes do óleo essencial pelo método do extraído fluido ou, através da utilização de álcool como solvente, pela obtenção de outros constituintes da planta que tenham atividade antifúngica. A Análise cromatográfica do extrato fluido poderá indicar. O extrato oleoso requer a utilização do Clevenger, já os outros extratos são preparados de forma mais simples e facilmemte reproduzível, o que nos mostra a vantagem destes outros métodos de extração que apresentam um custo menor. 

TABELA: Resultado do teste de microdiluição em caldo
Identificação dos isolados	Extrato fluído
(%)	Decocto
(%)	Óleo essencial
(%)	
M.p.01	6,25	25	0,25	
M.p.02	6,25	25	0,25	
M.p.03	6,25	25	0,125	
M.p.04	6,25	25	0,25	

4.	CONCLUSÃO

		Todos os extratos inibiram o crescimento dos fungos, o extrato oleoso obteve o melhor resultado, porém o rendimento obtido por esta forma farmacêutica é bem menor por grama de planta com relação aos outras formas de extração. 

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1]BERTELLI, D.; PLESSI, M.; MIGLIETTA, F. Effect of microwaves on volatile compouds in Origanum. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 36: 555-560, 2003.

[2]BURT, S. A.; REINDERS, R. D. Antibacterial activity of selected plant essencial oils against Escherichia coli O157: H7. Letters in Applied 	Microbiolgy. 36, 162-167, 2003.

[3]CARVALHO, J. C. T. Fitoterápicos anti-inflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. Ed. Tecmed, São Paulo (2004), p.480.

[4]CRESPO, M. J.; ABARCA,M.L.; CABAÑES, F.J.Occurrence of Malassezia spp in the external ear canals of dogs and cats with and without otitis external. Méd Mycol, v.40, p. 115-121, 2002.

[5]DAFERERA, J. D.; ZIOGAS, B. N.; POLISSIOU, M. G. CG-MS Analysis of Essential Oils from Some Greek Aromatic Plants and Their Fungitoxicity on Penicillium digitatum. J. Agric. Food Chem. 48: 2576-2581, 2000.

[6]EICHENBERG, M.L.; APPELT, C.E.; BERG, V.; MUSCHNER, A. C.; NOBRE, M.O.; MATTA, D.; ALVES, S.H.; & FERREIRO, L. Susceptibility of Malassezia pachydermatis to azole agents evaluated by a new broth microdilution method. Acta Scientiae Veterinariae, 31(2):75-80,2003.

[7]HAMMER, K. A.; CARSON, C.F.; RILEY, T.V. Antimicrobial activity of essential oils and other plants extracts. Journal of Applied Microbiology. 86: 985-990, 1999.

[8]LOBELL, R.; WIENGARTEN, A.; SIMMONS, R. Um novo agente para o tratamento da otite canina. A Hora Veterinária, v.88, Porto Alegre, p.29 -33,1995.

[9]MANOHAR, M.; INGRAM, C.; GRAY, J.; TALPUR, N. A.; ECHARD, W.; BAGCHI, D.; PREUSS, G. H. Antifungal activities of origanum oil against Candida albicans. Moecuar and Cellular Biochemistry. 228: 111-117, 2001.

[10]MATEKAIRE, T.; BWAKURA, T.B. Ethnoveterinary Medicine: A Potential Alternative to Orthodox Animal Health Delivery in Zimbabwe Intern J Appl Res Vet Med. Vol. 2, No. 4, 2004.

[11]NASCENTE, P.S. Malassezia pachydermatis em cães e gatos: estudo da freqüência e avaliação da sensibilidade aos antifúngicos cetoconazol, fluconazol e itraconazol. Pelotas-RS, 2001, 84p. Dissertação de Mestrado em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, 2001.

 [12]NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts: Approved Standard. M27 – A, 17, n.9, 1997.

[13]PLANT, J.D.; ROSENKRANTZ, W.S.; GRIFFIN,E.C. Factors associated with and prevalence of hight Malassezia pachydermatis numbers on dog skin. J.A.V.M.A., v.201,n.6,P.879-882,1992.

[14]SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO,J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Ed. da UFRGS/ed. da UFSC, Porto Alegre, RS/Florianópolis, SC, 2004, p.1002.

[15]SKOULA, M.; GOTSIOU, P.; NAXAKIS, G.; JOHNSON, C. B.  A chemosystematic investigation on the mono-and sesquiterpenoids in the genus Origanum (Labiatae). Phytochemistry 52 :649-657, 1999.