Title: Motilidade aos 10 minutos pós descongelamento de acordo com o tratamento utilizado
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CONGELABILIDADE DO SÊMEN SUÍNO DE ACORDO COM DIFERENTES TEMPOS DE ESTABILIZAÇÃO PRÉ-CONGELAMENTO

BIANCHI, Ivan^1; CORRÊA, Marcio Nunes^1; CALDERAM, Kérlin^1; LUCIA Jr. Tomaz^1; CORRÊA, Érico Kunde^1; PANZARDI, Andrea^1; ULGUIM, Rafael Rosa^1; PERONDI, Arlan^1; DESCHAMPS, João Carlos^1

^1 PIGPEL: Ensino, Pesquisa e Serviços em Produção de Suínos, Centro de Biotecnologia, Campus Universitário s/n°, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS, Caixa Postal 354, CEP 96010-900. ibianchi@ufpel.edu.br 

1. INTRODUÇÃO

O congelamento do sêmen é uma biotécnica reprodutiva importante para aumentar a eficiência de produção dos rebanhos, especialmente devido ao uso em maior escala de animais geneticamente superiores [10]. Porém, durante os processos de resfriamento, congelamento e descongelamento os espermatozóides são expostos a situações adversas a sua homeostase, tornando-os susceptíveis aos choques térmico e osmótico que podem promover alterações estruturais e funcionais na célula espermática, com prejuízos para a motilidade e nas trocas que ocorrem através da membrana plasmática [4, 5]. Em função destas injúrias celulares, pode ocorrer o comprometimento dos processos de capacitação e fertilização [12, 13, 15, 19], ou mesmo a morte celular [7, 19]. O sêmen suíno, antes do congelamento, precisa passar por um período de estabilização (tempo de resfriamento), para que os componentes do diluente possam interagir com as estruturas moleculares da membrana da célula espermática, e também para que estas estruturas se adaptem à exposição a baixas temperaturas, com a finalidade de aumentar a resistência espermática ao choque térmico [9]. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes tempos de estabilização pré-congelamento e seu efeito no descongelamento do sêmen suíno.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados dois machos (A e B) suínos cruzados (Landrace x Large White), com, aproximadamente, 18 meses de idade, que apresentavam fertilidade conhecida e que eram mantidos em baias individuais, sob as mesmas condições ambientais, na Estação Experimental da Palma, Universidade Federal de Pelotas (Brasil). Foram coletados dez ejaculados de cada macho. As coletas foram realizadas através do método da mão-enluvada [2], usando um copo plástico protegido por um copo isotérmico recoberto por gaze, a fim de separar a fração do ejaculado rico em gel. Somente a porção do ejaculado com a maior concentração espermática foi utilizada para ser criopreservada. As porções menos concentradas foram descartadas. Após a coleta do ejaculado, a concentração de células espermáticas foi realizada através do hematocitômetro. Também foi avaliada a motilidade (0 a 100%) espermática por microscopia ótica em aumento de 200x [3]. Somente ejaculados com motilidade superior a 70% foram utilizados. Imediatamente após a coleta do sêmen, uma alíquota de 10 mL da fração rica em espermatozóides foi diluída (1:1, v/v), em tubo cônico de 50 mL, em BTS [17]. Foram feitas duas curvas de resfriamento até 15°C. Na curva de resfriamento denominada Padrão, após a diluição inicial, os frascos permaneciam 90 m a 20°C e, após, 180 m a 15°C. Na curva de resfriamento denominada Curta, após a diluição, os frascos permaneciam 60 m a 20°C e, após, 60 m a 15°C. Após atingirem 15°C, os tratamentos foram submetidos à centrifugação (800 x g por 10 m), para retirada do plasma seminal. O pellet de espermatozóides obtido da centrifugação foi re-suspenso no diluidor de resfriamento (80%, v/v, de solução de lactose a 11%; 20%, v/v, gema de ovo; pH de 6,1) com uma concentração de 1,5 x 10^9 espermatozóides/mL [20]. Após, 2 mL da solução foram transferidos para tubos cônicos de 15 mL, realizando-se o resfriamento nas curvas Padrão e Curta, por 90 m a 5°C. Aos 5°C, os tubos cônicos com 2 mL de espermatozóides diluídos foram res-suspensos em 1 mL do diluidor de congelamento (89,5% de diluidor de resfriamento + 1,5% Orvus Ex Paste, Equex-Paste e 9% glicerol, v/v; pH de 6,83) para uma concentração final de 1,0 x 10^9 espermatozóides/mL e 3% de glicerol. Após a adição do diluidor de congelamento, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 mL (Minitüb, Germany), com concentração de 500 x 10^6 espermatozóides/palheta. As palhetas foram congeladas horizontalmente, 5 cm acima do vapor de nitrogênio líquido, por 20 m, sendo logo após estocadas em nitrogênio líquido a -196°C. O descongelamento das palhetas foi realizado a 50°C por 40 s em banho-maria com circulação de água. As palhetas foram re-suspensas (1:10, v/v) em tubos cônicos de 15 mL (16), no diluente BTS. Após o descongelamento, o sêmen foi incubado em tubos cônicos de 15 mL a 37°C para a avaliação da motilidade através de microscopia ótica a 200x, 10 e 30 m após o descongelamento. A motilidade entre os diferentes tratamentos foi comparada por análise de variância, com posterior comparação entre médias pelo método LSD. Todas análises foram realizadas com o software Statistix (2004). 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

No pré-congelamento, a motilidade média foi igual a 64,0%, tanto para a curva de resfriamento Padrão, quanto para Curta (Tabela 1). Portanto, a motilidade não diferiu entre as curvas de resfriamento (P > 0,05). Após o descongelamento, foi observada diferença (P < 0,05) na motilidade entre as curvas de resfriamento curta e padrão aos 10 m (39,0% e 34,5%, respectivamente), e aos 30 m (35,0% e 31,7%, respectivamente) (Tabela 1). 

Tabela 1: Motilidade espermática pré e pós-descongelamento de acordo com o tempo de resfriamento utilizado

Tempo de resfriamento | Momento da Avaliação
| Pré-congelamento | Pós-descongelamento
| | 10 m | 30 m
Padrão | 64,3 ^a | 34,5 ^x | 31,7 ^c
Curto | 64,2 ^a | 39,0 ^y | 35,0 ^d
Médias na coluna com letras diferentes diferem estatisticamente (P < 0,05)

Bwanga et al. [6], utilizando diversas curvas de congelamento, observaram diferenças na qualidade seminal pós-descongelamento, assim como Eriksson & Rodriguez-Martinez [8] observaram uma melhora de 5% e 4% na integridade de membranas para os períodos de incubação de 10 e 20 h a 17°C, respectivamente, em relação á incubação a 15°C por 3 h. De maneira similar, Katzer et al. [14] observaram que incubação prévia ou diminuição lenta da temperatura foi associada com redução na sensibilidade do sêmen ao resfriamento a 5°C. Porém, Garcia-Casado et al., [9] não observaram efeito na motilidade pós-congelamento em função de incubação pré-congelamento por 2,5, 3,5 ou 26 h. Também não foram observados efeitos sobre a motilidade de amostras de sêmen incubado a 15°C por 3 ou 24 h, ou sobre as taxas de prenhez obtidas posteriormente com este sêmen [11]. Neste estudo, o tempo de 120 m para a curva de resfriamento até 15°C foi suficiente para que as células espermáticas se estabilizassem no diluente, adquirindo resistência ao choque térmico, o que proporciona uma sensível redução no tempo necessário para a execução do processo de congelamento. Além disso, em função do menor tempo de permanência do sêmen em temperatura acima de 15°C, a produção de catabólitos será menor, em função da redução no metabolismo celular, havendo menor risco de proliferação bacteriana [1]. 

4. CONCLUSÕES

	A redução do tempo necessário para o sêmen atingir 15°C favoreceu a motilidade espermática do sêmen descongelado.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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