Title: SIMILARIDADE GENÉTICA BASEADA NA TÉCNICA IRAP EM FAMÍLIAS MUTANTES M3DE ARROZ
Author: fito
Company: UFPEL

SIMILARIDADE GENÉTICA BASEADA NA TÉCNICA IRAP EM FAMÍLIAS MUTANTES M_3DE ARROZ
CASTELO BRANCO, Juliana Severo^1; MARTINS, Andreza Figueirola^1; VIEIRA, Eduardo Alano^1; BERNARDES, Albina^1; MISTURA, Claudete^1; CARVALHO, Fernando Irajá Félix^1; OLIVEIRA, Antonio Costa de^1

^1Universidade Federal de Pelotas, Departamento de Fitotecnia, Centro de Genômica e fitomelhoramento, Campus Universitário, Caixa postal 354, Pelotas-RS, jcbrancov@hotmail.com

1. INTRODUÇÃO
A pesquisa do genoma das plantas vem contribuindo para estudos comparativos através de avanços obtidos nas áreas de biologia molecular, tendo como resultado um maior beneficio para os programas de melhoramento genético. Além disso, a utilização do arroz como genoma “modelo” pode facilitar os estudos, principalmente em função da grande sintenia entre os cereais. A análise de distância genética vem sendo amplamente utilizada por grupos de pesquisa, pois fornece a vantagem da avaliação simultânea de diversos caracteres para o dimensionamento da dissimilaridade entre as espécies. Este trabalho teve como objetivo avaliar a técnica IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorfism) para verificar o aumento de polimorfismo em famílias mutantes de arroz em relação a cultivar original BRS-Taim.

2. MATERIAL E MÉTODOS

 O trabalho foi realizado no Laboratório de Genômica do Centro de Genômica e Fitomelhoramento (CGF) da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas, localizado no município do Capão do Leão/RS.  Os genótipos utilizados pertencem ao banco de mutantes de arroz do CGF. A cultivar BRS Taim deu origem às famílias mutantes utilizadas neste estudo, as quais foram obtidas por mutação induzida por irradiação com raios gama (Co^60) na dose de 250 Gy. Foram utilizadas 20 famílias M_3 avaliadas em gerações M_1 e M_2 quanto às características morfológicas do sistema radicular, referente ao crescimento desuniforme de raízes e raízes de seminais curtas (Tabela 1). O DNA foi extraído a partir de amostras foliares de cada genótipo, por meio do método de extração CTAB[3]. A reação de amplificação foi realizada de acordo com a técnica IRAP [2], utilizando quatro primers dos LTR (Long Terminal Repeats) do elemento transponível TOS 17 que foram sintetizados a partir da descrição de suas seqüências [1]. 
A combinação das quatros seqüências possibilitou a formação de 10 combinações distintas como:  LTR-1 e LTR-1, LTR-1 e LTR-2; LTR-1 e LTR-3; LTR-1 e LTR-4; LTR-2 e LTR-2; LTR-2 e LTR-3; LTR-2 e LTR-4; LTR-3 e LTR-3; LTR-3 e LTR-4; LTR-4 e LTR-4.
Neste trabalho apenas seis combinações foram testadas, devido as combinações que possuíam o primer LTR-1 não terem amplificado. Os produtos das reações de amplificação (bandas) de cada um dos sistemas de marcadores utilizados IRAP foram classificados independentemente conforme presença (1) e ausência (0) de bandas. Os dados gerados a partir da análise de todos os indivíduos testados para cada um dos marcadores isoladamente e da análise conjunta de ambos, foram utilizados para o cálculo da similaridade genética entre todos os pares de indivíduos, com o auxílio do programa computacional NTSYS. Para o cálculo da similaridade genética, foi utilizado o coeficiente de Dice e com base na matriz de similaridade (MS_IRAP), foi construído o dendrograma por meio do método de agrupamento UPGMA. Para a verificação do ajuste entre a matriz de similaridade e o respectivo dendrograma, foi estimado o coeficiente de correlação cofenética (r). Estabilidade estatística do agrupamento foi estimada por meio da análise de bootstraping com 1000 replicações, com a utilização do programa computacional Winboot. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A técnica de agrupamento revelou um bom ajuste entre as distâncias apresentadas graficamente e a matriz original de distâncias, com uma correlação cofenética de 0,92. O dendrograma (Figura 1) foi construído utilizando 37 bandas polimórficas obtidas pela técnica IRAP, apresentando uma similaridade media de 0,70. O emprego da similaridade média como critério para a separação, propiciou a visualização dos grupos.  Foi possível identificar a similaridade existente entre as famílias 7 e 19 com valor de bootstraping (51,5%). O dendrograma permitiu verificar que a maioria das famílias testadas apresentaram baixo índice de mutação acessada pela técnica IRAP, pois apenas as famílias 3, 2 e 12 agruparam isoladas do grupo formado pela cultivar BRS-Taim. 

TABELA 1. Caracterização morfológica do sistema radicular das 20 famílias mutantes M_3 originadas da cultivar BRS Taim irradiadas com raios gama(Co^60)utilizadas.
Amostra | Família | mutante
1 | CGF-AR-M_3-389 | SC
2 | CGF-AR-M_3-350 | CD
3 | CGF-AR-M_3-407 | CD
4 | CGF-AR-M_3-337 | CD
5 | CGF-AR-M_3-397 | CD
6 | CGF-AR-M_3-351 | CD
7 | CGF-AR-M_3-404 | CD
8 | CGF-AR-M_3-348 | CD
9 | CGF-AR-M_3-405 | CD
10 | CGF-AR-M_3-437 | CD
11 | CGF-AR-M_3-421 | SC
12 | CGF-AR-M_3-415 | CD
13 | CGF-AR-M_3-393 | CD
14 | CGF-AR-M_3-399 | CD
15 | CGF-AR-M_3-436 | SC
16 | CGF-AR-M_3-437 | CD
17 | CGF-AR-M_3-444 | SC
18 | CGF-AR-M_3-439 | CD
19 | CGF-AR-M_3-433 | SC
20 | CGF-AR-M_3-435 | SC
21 | BRS-TAIM |

•	Raízes de seminais curtas (SC), Crescimento desuniforme de
 raízes seminais (CD)

0,70

45,0%

51,5%

36,9%

38,5%

50,5%

I

III

IV

II

Similaridade média entre grupos

FIGURA 1. Dendrograma de 20 famílias M_3 mutantes de arroz para o sistema radicular e da cultivar original de arroz BRS-TAIM obtido a partir da análise de IRAP utilizando o índice de similaridade de Dice (1945) e o método de agrupamento UPGMA. Os valores encontrados nos grupos indicam o valor percentual de vezes que os genótipos agruparam juntos em 1000 ciclos de análise de bootstraping utilizando o programa Winboot. O valor do coeficiente de correlação cofenética (r) é de 0,92. FAEM/UFPEL, Pelotas, 2004.

4. COCLUSÃO

Foi verificado que a maioria das famílias ficaram agrupadas, enquanto que  a família 3 mostra um maior índice de polimorfismo, sugerindo que carregue mutações em um maior número de loci.

5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1]HIRICHIKA, H., K. SUGIMOTO, Y. OTSUKI, H. TSUGAWA, and M. KANDA, Retrotransposon of rice involved in mutation by culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 7783-7788, 1996.

[2]KALENDAR, R.; GROB, T.; REGINA, M.; SUONIEMI, A,; SCHULMAN, IRAP and REMAP: two new retrotransposon based DNA fingerprinting techniques. Theor. Appl. Genet. 98: 704 – 711, 1999.

[3]SAGHAI-MARROF, M.A. et al. Ribosomal DNA spacer length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosome location and population dynamics. Proceedings of the national academy of sciences of the U.S.A, 89, 2:1477-1481,1984.