DETERMINAÇÃO DE Staphylococcus COAGULASE POSITIVA E DE INDICADORES HIGIÊNICO-SANITÁRIOS EM AMOSTRAS DE QUEIJO RALADO

Camacho, N. N.1*; Marini, P.1; Armas, R. D. de1; Ribeiro, G. A.1; Tessmann, C.1

1 Laboratório de Microbiologia  – DEMP – IB – UFPel
Campus Universitário s/n – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900
* nat_kota@yahoo.com.br

1. INTRODUÇÃO

	Alimentos como queijo têm se destacado como os derivados lácticos mais consumidos, devido ao seu alto teor de proteínas e outros nutrientes [9].
	O queijo ralado é um produto obtido por esfarelamento ou ralagem da massa de uma ou até quatro variedades de queijo de baixa umidade e aptos para o consumo humano, podendo ser parcialmente desidratado ou não [10]. É um alimento bastante consumido pela população brasileira por ser um produto pronto para o consumo, porém, ele pode oferecer alguns riscos à saúde da população uma vez que, durante sua produção, ocorrem várias etapas de processamento até chegar ao produto final.
	Sendo o leite um produto indispensável para a produção de queijos e demais derivados, é importante que este tenha um processamento de boa qualidade. O tipo mais comum de intoxicação alimentar é causado por uma toxina estafilocócica termoestável [4], sendo assim, o processo de aquecimento usado na pasteurização do leite irá destruir os Staphylococcus mas não as toxinas previamente produzidas, que permanecem ativas nos alimentos por um longo período [5].	
Além desses cuidados usuais necessários à produção de queijos em geral, o queijo ralado ainda passa por outras etapas onde mantém grande contato com equipamentos, e estes constituem-se em potenciais veículos de contaminação.
	Tanto bactérias oportunistas como patogênicas tem sido isoladas de superfícies e utensílios de cozinhas, determinando grave potencial de contaminação cruzada entre estes e os alimentos preparados em cozinhas industriais [13].
	Staphylococcus coagulase positiva são microrganismos de importância em alimentos por apresentarem risco para a saúde pública pela produção destas enterotoxinas. Em condições favoráveis o microrganismo multiplica-se no alimento, até alcançar altas cargas, produzindo as enterotoxinas, sem que sejam alterados significativamente a cor, o aroma e o sabor [12], causando intoxicação alimentar. Os principais sintomas dessa intoxicação são náuseas, vômito e diarréia, e em idosos e crianças a intoxicação estafilocócica pode ser fatal, caso esses indivíduos apresentem outras doenças [6].
	Alimentos contaminados por patógenos podem causar morbidade e mortalidade em todo o mundo e devido à grande escala de produção, qualquer falha no controle da higiene pode afetar grande número de pessoas. Os microrganismos indicadores da qualidade higiênico-sanitária dos alimentos podem fornecer informações sobre a provável presença de patógenos [11], como por exemplo o grupo dos coliformes.
	A presença de um elevado número de coliformes a 45°C em um alimento, inclusive nos processados, pode ser indicativo da presença de microrganismos de origem fecal e que, portanto, o alimento entrou em contato direta ou indiretamente com matéria fecal [2].
	Face a isto, objetivou-se neste trabalho pesquisar Staphylococcus coagulase positiva e indicadores de condições higiênico-sanitárias e de possível contaminação fecal em amostras de queijo ralado.

2. MATERIAL E MÉTODOS

	Foram analisadas quinze amostras de queijo parmesão ralado oriundas de estabelecimentos comerciais da cidade de Pelotas, RS. As análises foram realizadas durante os meses de junho e julho de 2004, seguindo a metodologia recomendada pelo Bacteriological Analytical Manual for Foods (1984) [7], no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas. 
	Assepticamente, foram pesadas 25g da amostra e homogeneizadas em liqüidificador com 225 mL de água peptonada 0,1%, constituindo-se assim a diluição 10-1. A seguir foram realizadas diluições decimais até 10-4. A partir de cada diluição transferiu-se 1 mL para três tubos de Caldo Lactosado (CL), que foram incubados a 37°C/48h. Após o período de incubação, considerou-se positivo os tubos que apresentaram bolhas no interior do tubo de Durham (tubo de fermentação), indicando a produção de gás a partir da lactose. Transferiu-se uma alçada de cada tubo positivo de CL para tubos de Caldo Lactosado Bile Verde Brilhante (CLBVB), incubados a 37°C/48h. Os tubos positivos no CLBVB foram repicados para tubos de caldo especial para Escherichia coli (EC), e incubados em banho-maria a 45°C/48h. Foi repicada uma alçada de cada tubo positivo para placas contendo Ágar EMB. 
	A estimativa do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e coliformes a 45°C foi realizada com base na tabela do NMP, através dos tubos positivos no CLBVB e EC, respectivamente.
	A determinação de Staphylococcus foi realizada pelo método da contagem direta em placas. Usando-se as mesmas diluições utilizadas na análise de coliformes, foi inoculado 1 mL de cada diluição em 3 placas de Ágar Baird-Parker. As placas foram incubadas a 37ºC/48h. Selecionou-se placas com 20 a 200 colônias, e contou-se as colônias típicas de Staphylococcus. Foram selecionadas 2 colônias típicas de cada placa e inoculadas em ágar nutriente para posterior teste de coagulase. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
	
	Houve a contagem de coliformes totais em seis das quinze amostras (40%), com valores que variavam de 4,3 x 103 a 1,1 x 105 NMP.g-1 de queijo ralado. 
	Quanto à presença de coliformes a 45ºC, apenas duas amostras (13,3%) apresentaram contagens, com valores de 2,3 x 103 e 1,1 x 105 NMP.g-1. Portanto, ambas as amostras apresentaram-se fora dos padrões estipulados pela legislação vigente, que preconiza um limite máximo de 103 NMP de coliformes a 45ºC por grama de queijo ralado, demonstrando estarem impróprias para o consumo segundo a ANVISA [1].
	As culturas de coliformes a 45ºC provenientes destas duas amostras foram caracterizadas bioquimicamente como Escherichia coli. 
	Das quinze amostras de queijo ralado analisadas para Staphylococcus, quatro (33,3%) apresentaram teste positivo para coagulase. Estas amostras apresentaram contagens acima do limite máximo permitido pela legislação, que é de 103 UFC/g-1 de queijo ralado. As contagens variaram de 1,3 x 105 a 9,9 x 105 UFC/g-1, demonstrando que as amostras encontravam-se impróprias para o consumo humano de acordo com a legislação vigente [1]. Segundo BOARI et al. [3], colônias positivas para coagulase podem corresponder à cepas de estafilococos potencialmente produtoras de enterotoxinas e, portanto, representar riscos ao consumidor. 
	Ressalta-se que em uma das amostras onde houve alta contagem de coliformes a 45ºC, foi confirmada Escherichia coli e também obteve-se a maior contagem de Staphylococcus coagulase positiva entre as amostras analisadas. Outro fator agravante é que o queijo ralado, quando exposto ao consumidor em estabelecimentos comerciais, não é mantido sob temperatura de refrigeração (4°C) como os demais queijos, o que favorece o desenvolvimento de Staphylococcus e de coliformes a 45°C, assim como a conseqüente produção de enterotoxinas estafilocócicas, acarretando possíveis riscos ao consumidor.
Os resultados microbiológicos encontrados por PIMENTEL et al. [10] em análises realizadas com queijo ralado foram negativos para Staphylococcus coagulase positiva, coliformes a 35ºC e a 45ºC, Salmonella spp. e leveduras. Estes resultados são coerentes com os baixos teores de umidade, baixa atividade de água e com a presença de conservadores nas amostras, fatores que também foram analisados por estes autores. Todas as amostras estavam, portanto, de acordo com os limites de tolerância estabelecidos pela legislação vigente [1]. 
	Ainda neste trabalho, PIMENTEL et al. [10] relatam que o ácido sórbico, comumente utilizado como conservante em queijos ralados, apresenta um amplo espectro de atuação, sendo eficiente na inibição do crescimento de várias espécies bacterianas, como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, e de bolores e leveduras. Segundo o autor, este pode ser um dos fatores que justificam os baixos níves de contaminação encontrados. 
	FRANCO & ALMEIDA [8] em trabalho semelhante avaliaram 10 amostras de queijo tipo parmesão ralado embalado à vácuo, adquiridas em Niterói, RJ. Estes autores observaram que 100% das amostras atenderam aos critérios estabelecidos pela portaria nº 451, de 1997, que além de preconizar limites de coliformes a 45ºC e de Staphylococcus coagulase positiva, previa também a determinação de coliformes a 30ºC, contagem de bolores e leveduras e de Listeria monocytogenes.

4. CONCLUSÕES
	
	Quanto à presença de coliformes a 45ºC, duas amostras (13,3%) apresentaram contagens superiores ao padrão estipulado pela legislação, estando em condições insatisfatórias para o consumo humano.
	Staphylococcus coagulase positiva foi encontrado em quatro amostras (33,3%), com contagens superiores as permitidas pela legislação vigente, portanto impróprias para o consumo humano.
	Salienta-se que em uma das amostras onde ocorreu alta contagem de coliformes a 45ºC também obteve-se a maior contagem de Staphylococcus coagulase positiva, com valores fora dos padrões estipulados pela legislação.  

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Ministério da Saúde. Resolução RDC nº 12. Diário Oficial da União, Brasília, 2 de janeiro de 2001. 
[2] BARBOSA, M. B. C.; SANTOS, T. M. dos; SANTOS, W. L. M.; MARTINS, N. M.; MAURA, R. Avaliação da qualidade microbiológica de linguiças frecais de carne suina no município de Sete Lagoas. Revista Higiêne Alimentar. v. 17. n. 104/105. p.20-21. Jan/fev 2003.
[3] BOARI, C. A.; PICCOLI-VALLE, R. H.; NASCIMENTO, A. R.; MARQUES, S. C.; ALCANTARA, E. M. C. Ocorrência de cepas de estafilococos coagulase positiva formadoras de colônias atípicas em Ágar Baird Parker. Revista Higiene Alimentar. v.17. n. 104/105. p. 28-29. jan/fev 2003.
[4] BROOKS, G. F.; BUTEL, J. S.; ORNSTON, L. N.; Microbiologia Médica. 20ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998. 524 p.
[5] CARMO, L. S. do; DIAS, R. S.; LINARDI, V. R.; SENA, M. J. de; SANTOS, D. A. dos; FARIA, M. E. de; PENA, E. C.; JETT, M.; HENEINE, L. G. Food poisoning due to enterotoxigenic strains of Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazil. Food Microbiology, v. 19, p. 9-14, 2002.
[6] CLEMENTE, M. das G.; VALLE, R. H. P. do; ABREU, L. R. de. Staphylococcus em queijos fabricados com leite cru e pasteurizado. Revista Higiêne Alimentar. v.17 n.104/105. p. 38-39. jan/fev 2003. 
[7] FDA – Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual for Foods, USA: Association of Official Analytical Chemists, 1984.
[8] FRANCO, R. M.; ALMEIDA, L. E. F. Avaliação microbiológica de queijo ralado tipo parmesão comercializado em Niterói, RJ. Revista Higiene Alimentar. v. 6. n. 01. p. 33-36, 1992.
[9] ORMENESE, R. de C. S. C. ; SILVEIRA, N. F. A. ; SILVA, N. da. Escherichia coli 0157:H7 em alimentos. In: Bol. SBCTA, 33(1):41-49, jan/jun 1999.
[10] PIMENTEL, E. F.; DIAS, R. S.; RIBEIRO-CUNHA, M.; GLÓRIA, M. B. A. Avaliação da rotulagem e da qualidade físico-química e microbiológica de queijo ralado. Ciência e Tecnologia de Alimentos. Campinas, 22(3): 289-294, set/dez. 2002.
[11] RALL, V. L. M.; ARAGON, L. C.; BOMBO, A. J.; LOPES, T. F.; SILVA, M. G. Pesquisa de Staphylococcus aureus e de indicadores higiênico-sanitários em leite e derivados comercializados na cidade de Botucatu. Resumos XXI Congresso Brasileiro de Microbiologia. Foz do Iguaçú – PR. 2001. p. 411. AL 180.
[12] SANTOS, W. L. M. Avaliação microbiológica de saladas cruas e cozidas servidas em restaurantes industriais da cidade de Belo Horizonte. Revista Higiene Alimentar. v. 11. n. 40. p.26-30. 1997.
[13] SILVA, C. H. P. de M.; NETTO, H. T. Determinação da contaminação de utensílios e superfícies por coliformes e Staphylococcus coagulase positiva em cozinha hospitalar. Revista Higiêne Alimentar. v.17. n.104/105. p. 188. jan/fev 2003.