Universidade Federal de Pelotas
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CADASTRO DE PROJETO DE PESQUISA
 Dados do Projeto
Código: 5.05.02.128
Título do Projeto
DESENVOLVIMENTO DE TESTE DIAGNÓSTICO PARA LEPTOSPIROSE BOVINA ATRAVÉS DA POLARIZAÇÃO DA FLUORESCÊNCIA
Data de cadastro
06/04/2009
Unidade
Faculdade de Veterinária
Departamento
Faculdade de Veterinária
Objetivos
Desenvolver e padronizar um teste diagnóstico baseado em insumo biológico marcado para detecção de anticorpos anti Leptospira no soro de bovinos para o diagnóstico de leptospirose
Subárea de conhecimento
5.05.02.03-4 (CNPq)
Grupo de Pesquisa do Coordenador
CCZ/UFPEL
Prazo de execução
48 meses
Início
01/12/2008
Término
02/12/2012
Fonte financiadora
CNPq
Valor liberado
R$ 59.969,00
Coordenador do Projeto
SIAPE Nome E-mail HS
2497377 Claudia Pinho Hartleben Fernandes claudia.hartleben@pq.cnpq.br 5
Colaboradores
Nome Instituição HS
Fabiana Kommiling SeixasUFPEL2
Claudiomar Soares Brod UFPEL2
Ana Lúcia RecueroUFPEL2
Odir DellagostinUFPEL2
Fabrício Rochedo ConceiçãoUFPEL4
Alunos envolvidos
Unidade Nome Curso HS
FVSérgio JorgePós Graduação em Veterinária10
Envolve experimentação com modelos animais? NÃO - Registro no CEEA:
Envolve experimentos utilizando vírus, microorganismos patogênicos, ou organismos geneticamente modificados? SIM
Possui Certificado de Qualidade em Biossegurança ou em processo de qualificação? SIM



Resumo:

A leptospirose é doença infecciosa que acomete todos os mamíferos, inclusive o homem, sendo causada por bactérias do gênero Leptospira. Entre as espécies de animais domésticos destacam-se os bovinos, eqüinos, ovinos e caprinos como suscetíveis a infecção e reservatórios da doença. A leptospirose nos rebanhos bovinos caracteriza-se pelo aborto, nascimento de terneiros fracos, morte neonatal, diminuição ou parada da produção de leite e perda de peso, acarretando, junto com outras doenças infecciosas, perdas econômicas importantes ao produtor e a economia dos países produtores de carne e leite. O diagnóstico diferencial da leptospirose de outras doenças infecciosas que também causam transtornos reprodutivos, os quais resultam na diminuição da produção animal, é importante para a implantação e monitoramento de programas sanitários. A técnica padrão para o diagnóstico laboratorial da leptospirose é a soroaglutinação microscópica (MAT), e está baseada na detecção de anticorpos circulantes no sangue através da reação com uma coleção de cepas da bactéria, devido a sua variação antigênica atribuída a composição do lipopolissacarídeo (LPS) presente na membrana externa da bactéria. Porém a MAT, apesar da alta especificidade, possui baixa sensibilidade a qual é atribuída à impossibilidade do uso de todos os sorovares no diagnóstico, curva de crescimento bacteriano e concentração de bactérias. Além disto, é uma técnica laboriosa, necessitando o cultivo permanente no laboratório e a manutenção da virulência de cepas, através da inoculação periódica das cepas em modelos biológicos e requerer profissionais treinados para realização da leitura comparativa com sorovares controles. Na última década, a intensificação do estudo molecular da Leptospira resultou na identificação e caracterização de várias proteínas quanto a sua presença exclusiva em leptospiras patogênicas, expressão in vitro e in vivo e localização na célula bacteriana. Entre estas, a proteína LipL32, na sua forma recombinante (rLipL32) tem sido citada em estudos de desenvolvimento de testes diagnósticos baseados em ELISA, Aglutinação em Látex e Lateral Flow para detecção de anticorpos e a amplificação do gene lipl32 pelas técnicas de PCR e Nested PCR para detecção de Leptospira em fluídos biológicos. Porém, independente da sensibilidade e especificidade destes novos testes diagnósticos relatados, estes não estão disponíveis para uso na rotina clínica do médico veterinário ou para estudos de epidemiologia sorológica em rebanhos bovinos. Testes rápidos para detecção de anticorpos anti Brucella em soros de bovinos foram desenvolvidos utilizando biotécnicas para produção de insumos diagnósticos, constituídos de antígenos específicos marcados com fluoróforos, permitindo a utilização de máquinas leitoras de precisão, resultando em diagnósticos rápidos e precisos, estando já disponíveis para o diagnóstico da brucelose bovina por polarização da fluorescência. O uso da polarização da fluorescência para diagnóstico de leptospirose foi relatada por BUGHIO e colaboradores, 1999. Contudo, o antígeno anteriormente utilizado para detecção de anticorpos, uma proteína do flagelo bacteriano, não apresenta dominância antigênica na bactéria e sua presença em todos os sorovares patogênicos não foi comprovada. Por este motivo, o objetivo deste projeto é o desenvolvimento de um teste diagnóstico rápido, baseado na identificação de anticorpos no soro de bovinos utilizando um antígeno protéico imunodominante e presente em todos os sorovares patogênicos para a produção de um insumo biológico, viabilizando o diagnóstico em populações animais pelo baixo custo, praticidade e rapidez. A metodologia proposta compreende a conjugação da proteína de membrana externa LipL32, em sua forma recombinante, com o fluoróforo isotiocianato de fluoresceína (FITC) e aplicação deste insumo para o desenvolvimento de um teste diagnóstico rápido e específico. O insumo diagnóstico produzido (conjugado rLipL32/FITC) será utilizado para a padronização de um teste diagnóstico para leptospirose bovina, utilizando soros controles padronizados; posteriormente será aplicado em estudo cego para avaliação da sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade e, finalmente em amostras de soro de animais suspeitos de leptospirose. O produto final do projeto é o desenvolvimento de um kit diagnóstico para leptospirose bovina, o qual será comparado com o padrão diagnóstico MAT para validação.