AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DUAS ESPÉCIES DE MIKANIA SOBRE ESTREPTOCOCOS ORAIS
LUND, Rafael Guerra1; SERPA, Rosana2; YATSUDA, Regiane3; RIBEIRO, Gladis Aver2; REHDER, Vera Lúcia Garcia3; ROSALEN, Pedro Luiz3; DEL PINO, Francisco Augusto Burkert1

1Programa de Pós-Graduação em Odontologia, área de concentração em Dentística – UFPel
2Departamento de Microbiologia e Parasitologia – IB/UFPel
3Programa de Pós-Graduação em Odontologia – UNICAMP
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. rglund@ufpel.edu.br 

1.	INTRODUÇÃO

Atualmente está bem estabelecido que a cárie dental é uma doença multifatorial infecto-contagiosa associada a bactérias patogênicas residentes da biofilme dental. Estes microrganismos são os responsáveis pela produção de ácidos e produtos citotóxicos que levam à desmineralização do esmalte dental. Os estreptococos do grupo mutans, além de serem acidogênicos e acidúricos, não só fermentam a sacarose como a partir desta, sintetizam polissacarídeos extracelulares (Ikeno et al., 1991; Israelson, 1991). Esta síntese é feita por enzimas chamadas genericamente de glucosiltransferases que facilitam a aderência dos estreptococos do grupo mutans, permitindo o seu acúmulo sobre a superfície lisa do esmalte dental. Inicia-se, assim, a formação do biofilme dental relacionado à cárie (Napimoga et al., 2005)
Deste modo, o uso de agentes antimicrobianos eficientes contra estes patógenos bucais pode ser importante na prevenção da cárie dental (Osawa et al., 2002; Wu-Yan et al., 1988; Yatsuda et al., 2005).   
Produtos naturais são fontes promissoras de novos antibióticos e sua crescente valorização tem o intuito de minimizar o surgimento de cepas de microrganismos resistentes e oportunizar o surgimento de novos fármacos. 
Espécies do gênero Mikania, são de particular interesse devido às suas múltiplas propriedades farmacológicas, como ação antiinflamatória e atividade antimicrobiana. No Brasil ocorrem cerca de 192 espécies e elas são encontradas principalmente nas regiões Sul e Sudeste, desenvolvendo-se como trepadeira arbustiva, lenhosa, apresentando caule cilíndrico e ramoso, florescendo de agosto à outubro (Farmacopéia dos Estados Unidos do Brasil, 1959). 
Estudo prévio de Yatsuda et al. (2005) já havia demonstrado os efeitos antibacterianos das espécies M. glomerata e M. laevigata (dois tipos de “guaco”)  no crescimento de células planctônicas e aderência celular de estreptococos orais. 
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de duas espécies de Mikania no crescimento e aderência celular de estreptococos do grupo mutans.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas nos ensaios antimicrobianos cepas puras de coleção: Streptococcus mutans UA159 e Streptococcus sobrinus 6715. Extratos etanólicos (EtOH 100%, v/v), obtidos de folhas secas de Mikania glomerata Spreng. (popularmente conhecida por “guaco”) e Mikania hirsutissima DC. (“cipó-cabeludo” ou “guaco-cabeludo”), foram testados nesta pesquisa. 
Os efeitos destes extratos sobre estreptococos orais foram analisados através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM) e teste de aderência celular em superfície de vidro. 
	Preparo das suspensões bacterianas: Os microrganismos foram inicialmente reativados a partir das suas culturas originais mantidas em meio líquido BHI (Brain Heart Infusion) contendo 20% de glicerol à –800C e posteriormente cultivados em placas de ágar BHI e Ágar Columbia contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro nas seguintes condições: temperatura de 370C, em atmosfera de 10% CO2 por 18-24 horas. Colônias isoladas foram então ressuspendidas em 5mL de solução de NaCl 0.89% estéril até atingir uma turbidez equivalente na escala 0,5 de Mc.Farland (1,5 x 108 bact/mL). A suspensão assim obtida foi utilizada para as determinações descritas a seguir.
	Concentração Inibitória Mínima (CIM): A determinação do CIM foi realizada em meio líquido, através da técnica de macrodiluição (Phillips, 1991; Piddock, 1990). Para isto, cada suspensão bacteriana foi homogeneizada em caldo BHI na proporção 1:1000 (v/v), de modo a obter uma concentração bacteriana em torno de 1-2 x 105UFC/mL. Após a homogeneização, 4960?L foram transferidos em tubos de vidro estéreis, sendo posteriormente pipetados 40?l dos extratos de Mikania glomerata e Mikania hirsutissima (com concentração final variando entre 2,5 e 177,8?g/mL) ou controle negativo (etanol absoluto). Os tubos foram em seguida homogeneizados com auxílio de um vórtex em baixa velocidade e incubados nas mesmas condições descritas anteriormente (temperatura de 37oC e 10% de CO2). A CIM foi considerada a menor concentração do extrato onde não houve crescimento bacteriano visível, ou seja, uma leitura da absorbância a 600nm menor que 0,05. 
Concentração Bactericida Mínima (CBM): Os tubos incubados para determinação da CIM em meio líquido foram utilizados para determinação da CBM (Phillips, 1991; Piddock, 1990). Uma alíquota (50?l) foi inoculada em placas de Ágar Columbia suplementado com 5% de sangue de carneiro e posteriormente as placas foram incubadas em ambiente a 37oC e 10% CO2. A CBM foi considerada a menor concentração do extrato onde não houve crescimento celular sobre a superfície do ágar inoculado (99,9% de morte microbiana).
Teste de Aderência Celular à Superfície de Vidro: Foi preparado meio de cultura BHI caldo com 1% de sacarose. A inoculação do meio também foi na proporção de 1:100. O meio inoculado foi distribuído (2480L) em tubos de vidro rosqueados e foram acrescentados 20L das amostras de extratos. Para o controle negativo, utilizou-se 20L de etanol absoluto. Após agitação, os tubos foram dispostos numa angulação de 30o e incubados por 18h, a 37oC e 10% de CO2. Para leitura em espectrofotômetro, as células bacterianas aderidas aos tubos foram lavadas e o seu sobrenadante descartado. Este procedimento foi repetido duas vezes. Depois, foram adicionados 4,5mL de tampão fosfato de potássio 0.05M, pH 6.8, contendo 0.02% de azida sódica e procedeu-se a seqüência: agitação em aparelho vórtex, ultrassom, e  desprendimento das células bacterianas aderidas com auxílio de bastão de vidro. Com isto, foi finalizado o procedimento para realização da leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 550nm (luz visível). Os resultados foram obtidos pelo cálculo da diferença entre o valor encontrado e o valor obtido pelo controle.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 1 apresenta a Concentração Inibitória Mínima (CIM), a Concentração Bactericida Mínima (CBM) e a concentração de inibição total da aderência bacteriana (CITAB) dos extratos etanólicos de Mikania frente os estreptococos orais testados.

Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima 
CBM) e concentração de inibição total da aderência bacteriana (CITAB) dos extratos 
etanólicos de M. hirsutissima e M. glomerata sobre Streptococcus do grupo mutans, 
expressas em µg/mL:

	Mikania glomerata	Mikania hirsutissima	
	CIM	CBM	CITAB	CIM	CBM	CITAB	
S. mutans UA159	88,90	88,90	40	44,45	88,90	20	
S. sobrinus 6715	44,45	44,45	40	22,23	44,45	20	

No que se refere ao extrato etanólico de M. glomerata, tanto a concentração inibitória mínima (CIM) quanto a concentração bactericida mínima (CBM) foram semelhantes, ou seja, 88,90µg/mL para S. mutans UA159 e 44,45µg/mL para S. sobrinus 6715. 
Com relação ao extrato etanólico de M. hirsutissima, a CBM foi superior à CIM. Neste caso, a CIM para S. mutans UA 159 foi 44,45µg/mL e a CBM foi 88,90µg/mL. Para S. sobrinus 6715, a CIM foi 22,23µg/mL e a CBM 44,45µg/mL.
		A aderência celular dos microrganismos testados foi inibida na concentração de 20µg/mL para M. hirsutissima e 40µg/mL para M. glomerata. A aderência celular dos Streptococcus do grupo mutans é um dos fatores de virulência destes microrganismos e com base nestes resultados o extrato de M. hirsutissima necessitou de uma concentração menor para inibir a aderência bacteriana.
Estes resultados corroboram com os achados do estudo de Yatsuda et al. (2005) no que diz respeito ao potencial antimicrobiano do extrato etanólico de M. glomerata. Neste estudo prévio, o extrato etanólico apresentou CIM de 25µg/mL e CBM de 100µg/mL para S. sobrinus 6715 e para as demais linhagens de S. sobrinus e S. mutans testadas a CIM variou de 25 a > 800µg/mL e a CBM de 50 a > 800µg/mL. A inibição total da aderência bacteriana à superfície de vidro ocorreu nas concentrações de 25µg/mL para S. sobrinus 6715 e para as demais linhagens de S. sobrinus e S. mutans testadas oscilou de 25 a 400µg/mL.

4. CONCLUSÕES

Com base neste estudo, concluímos que os extratos etanólicos de M. hirsutissima e M. glomerata inibem o crescimento e a aderência celular de S. mutans e S. sobrinus, demonstrando potencial antimicrobiano e, portanto podem ser explorados como prováveis agentes no controle do biofilme oral. Estudos de fracionamento e purificação desses extratos estão sendo realizados para identificação dos compostos ativos.
5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

FARMACOPÉIA DOS ESTADOS UNIDOS DO BRASIL. 2. ed. São Paulo: Siqueira, 1959.
IKENO, K.; IKENO, T.; MIYAZAWA, C. Effects of propolis on dental caries in rats. Caries Research, 1991, 25, p. 347-351.
ISRAELSON, L. The role of natural products in oral health care. Journal of Clinical Dentistry, 1991, (Spec. Iss), p. 5-6.
NAPIMOGA, M. H.; HOFLING, J. F.; KLEIN, M. I.; KAMIYA, R. U.; GONÇALVES, R. B. Transmission, diversity and virulence factors of Streptococcus mutans genotypes. 
Journal of Oral Science, 2005, 47, p. 59-64.
OSAWA, K. YASUDA H, MARUYAMA T, MORITA H, TAKEYA K, ITOKAWA H. Isoflavanones from the heartwood of Swartzia polyphylla and their antibacterial activity against cariogenic bacteria. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1992, 40, p. 2970-2974.
PHILLIPS, I. A guide to sensitivity testing. The Journal of Antimicrobial 
Chemotherapy, 1991, 27, p. 1-50.
PIDDOCK, L. J. V. Techniques used for the determination of antimicrobial resistance
and sensitivity in bacteria. The Journal of Applied Bacteriology, 1990, 68, p. 307 –
318.
WU-YUAN, C.D.; CHEN, C.Y.; WU, R.T. Gallotannins inhibit growth, water-insoluble glucan synthesis and aggregation of mutans streptococci. Journal of Dental Research, 1988, 67, p. 51-55.
YATSUDA, R.; ROSALEN, P. L.; CURY, J. A.; MURATA, R. M.; REHDER, V. L. G.; Effect of Mikania genus plant on growth and cell adherence of mutans streptococci. Journal of Ethnopharmacology, 2005, 97, p. 183-189.