EVIDENCIAÇÃO DE MICRONÚCLEOS EM CÉLULAS ESFOLIADAS DA MUCOSA ORAL APÓS CLAREAMENTO DENTAL UTILIZANDO PERÓXIDO DE CARBAMIDA

ALMEIDA, Aline1, MAGALHÃES, Bianca1; FÔLHA, Clarissa1; DEMARCO, Flávio Fernando2; PALUDO, Laura1; ETGES, Adriana3

1Graduandas do Curso de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas
2 Disciplinas de Metodologia do Aprendizado e Pesquisa I e II – Faculdade de Odontologia - UFPel
3 Disciplinas de Patologia Geral, Unidade de Diagnóstico I e II e Centro de Diagnóstico das Doenças da Boca – Faculdade de Odontologia – UFPel 

1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO
Para o clareamento de dentes vitais o peróxido de carbamida vem sendo largamente utilizado, no entanto uma preocupação quanto ao seu emprego está relacionada ao seu possível potencial carcinogênico.
A pesquisa de micronúcleos tem emergido como um método preferencial para medir o dano cromossômico, tratando-se de um método simples, rápido, sensível, não invasivo e que não requer cultivo celular. Apresenta um baixo custo, sendo usada como biomarcador para detecção de pacientes com risco de desenvolver câncer e também para monitorar a ação de quimioprotetores.
O estudo intitulado “Evidenciação de Micronúcleos em células esfoliadas da mucosa oral após clareamento utilizando peróxido de carbamida” que está sendo realizado na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas tem por objetivo avaliar a freqüência dos micronúcleos empregando a técnica de Feulgen, em células esfoliadas da mucosa oral de pacientes submetidos ao clareamento dental utilizando como agente clareador o Peróxido de Carbamida nas concentrações de 10 e 16%.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
Neste período de setembro de 2005 a maio de 2006 foi executado pequenos ajustes na Técnica de Feulgen e no armazenamento das células.
Foram coletadas células de 10 pacientes, sendo que os 3 tempos de coleta foram estabelecidos, o primeiro antes do início do clareamento dental, outro após 15 dias do início e o último após 45 dias do início do tratamento, totalizando 30 amostras finais. Estes tempos foram programados no projeto para termos amostras de antes e durante a aplicação do agente clareador, e depois do tempo de reestabelecimento da mucosa após o tratamento instituído.
As células da mucosa oral foram coletadas utilizando escovas citológicas, e em seguida o conjunto (escova mais células) foi colocado em tubo de ensaio contendo 2mL de tampão fosfato e 8mL de água destilada. Após, foi agitado o tubo em agitador elétrico e deixado em repouso por meia hora. A seguir, foi retirada a escova citológica e levado o tubo contendo os 2mL de tampão fosfato, 8mL de água destilada e a es células para centrifugação por 10 minutos em rotação de 1000rpm. Então, foi removido o sobrenadante permanecendo 1mL no tubo. Em seguida foi adicionado 9mL de fixador (constituído de 3 partes de metanol para 1 parte de ácido acético) e realizados movimentos para ressuspender o material e, em seguida, foi levado ao freezer por 30 minutos. Passado este tempo os tubos foram centrifugados por 30 minutos em velocidade de 30rpm e em seguida foi o fixador. Repetiu-se os movimentos para ressuspender o material e a centrifugação por mais 30 minutos (1000rpm). Depois, o sobrenadante foi desprezado permanecendo 0,5mL de material no tubo de ensaio. Após, foi pingado de 3 a 4 gotas do conteúdo do tubo em lâminas previamente secas em estufa a 37°C. Foi flambada a lâmina com o material tendo o cuidado de não deixar queimar. Em seguida, as lâminas foram coradas pela Técnica de Feulgen. Esta consiste na fixação das células através da oxidação em solução de ácido clorídrico 1N a temperatura ambiente por 1 minuto. Após as lâminas foram escorridas e colocadas em ácido clorídrico por 10 minutos em estufa acima de 33ºC, deixando esfriar posteriormente à temperatura ambiente durante 10 minutos. A seguir foram novamente imersas em ácido clorídrico por 5 minutos. Em seguida foi realizada a lavagem das lâminas em água destilada, duas passagens de 5 minutos cada. Após foi feita a secagem das mesmas à temperatura ambiente. 
Procedeu-se a coloração com reagente de Schiff por 2 horas e trinta minutos à temperatura ambiente, em ambiente escuro. A seguir, o reagente foi removido e as lâminas foram cobertas por água destilada tamponada por 1 minuto. Após foi realizada a lavagem em água destilada e as lâminas secas. Vinte e quatro horas depois, as lâminas foram imersas no corante Fast green por 10 segundos, sendo após lavadas em álcool, por 3 vezes e por 10 segundos cada.
Os micronúcleos foram visualizados em microscópio óptico comum, com objetiva de 100x e oculares de 10x em lâminas identificadas, e a determinação da proporção de micronúcleos foi mediante a contagem manual de micronúcleos em 1000 células por campo.
Os critérios utilizados para caracterizar a formação de micronúcleos foram os mesmos adotados por Araújo, em 2001 que afirma que: (a) devem ter um contorno regular, redondo ou oval e estar dentro do citoplasma da célula; (b) apresentarem coloração semelhante ao núcleo principal; (c) seu diâmetro deve ser menor que 1/3 do diâmetro do núcleo principal; (d) devem estar no mesmo plano de foco do principal; (e) deve estar separado ou marginalmente justaposto ao núcleo principal, de modo que haja identificação clara do limite nuclear de ambos.

3. RESULTADOS
 Os resultados foram obtidos através da contagem dos micronúcleos visualizados em microscópio óptico comum, com objetiva de 100x e oculares de 10x em lâminas identificadas. A determinação da proporção de micronúcleos foi mediante a contagem manual de micronúcleos em 1000 células por campo (Tabela 1).
Tabela 1. Resultados referentes às amostras e aos tempos de tratamento com o agente clareador peróxido de carbamida nas concentrações 10 e 16%.
Grupos/Amostras	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	
Baseline	0	0	0	3	0	1	0	0	0	0	
15 dias	9	6	2	4	1	2	3	3	1	4	
45 dias	2	4	16	8	2	1	0	0	7	4	

Os dados da Tabela 1. foram analisados pelo teste estatístico comparando os grupos baseados no rank de resultados (Kruskal-Wallis, P=0,002) Tabela 2., mostrando diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Foi aplicado o teste de Tukey para a comparação múltipla entre os grupos, o qual também demonstrou diferença estatisticamente significativa do grupo 1 (baseline) com o 2 (15 dias) e 3 (45 dias), não sendo significativa a diferença entre os grupos 2  (15 dias) e 3 (45 dias) Tabela 3.

Tabela 2. Teste de Kruskal-Wallis, o qual compara as médias dos grupos
Grupos	Número de casos	Média	
1	10	0,000	
2	10	4,000	
3	10	7,000	
(P=0,002)

Tabela 3. Teste de Tukey, o qual faz a comparação múltipla dos grupos
Grupos	Rank	q	
2/1	123,500	4,436	Sim	
2/3	11,500	0,413	Não	
3/1	112,000	4,023	Sim		
(P<0,05)

Figuras 1. e 2. mostrando imagens coletadas das lâminas dos experimentos. Técnica histoquímica de Feulgen.

Figura 1. Células esfoliadas da mucosa oral não apresentando micronúcleos

Figura 2. Células esfoliadas da mucosa oral após o uso do agente clareador peróxido de carbamida nas concentrações 10 e 16%.

4. CONSIDERAÇÔES FINAIS
Foram implementadas modificações ao projeto no intuito de obtermos melhor qualidade de resultados. 
Implementamos a utilização de escovas citológicas para remoção das células, as quais promovem maior número celular e menor desconforto no processo de coleta. Adicionado a isto, introduzimos uma forma de armazenamento por congelamento que propicia utilização das células coletas diminuindo as perdas por esgotamento de material ou erro na técnica.
Diminuímos de quatro para três tempos de coleta, uma vez que os tempos para o clareamento dental foram também diminuídos, acompanhando assim os critérios, estabelecidos anteriormente no início, meio e final da aplicação dos agentes clareadores.
A calibração dos pesquisadores envolvidos na coleta, bem como a forma de armazenamento, aplicação das células esfoliadas na lâmina e identificação das estruturas referentes aos micronúcleos foram satisfatórias. O protocolo de armazenamento tem a vantagem de que após a aquisição do material, este pode ser acondicionado em geladeira por até 24h, para então ser processado. Assim, se algum imprevisto ocorrer durante o processamento ocorrer durante o processamento da lâmina o material estará armazenado adequadamente e possibilitará a reposição deste, não arriscando os resultados da pesquisa. Outro ponto relevante está na calibração dos pesquisadores no que diz respeito à técnica de coloração das lâminas, pois estas devem estar coradas com contraste adequado, facilitando a visualização da morfologia e de estruturas importantes (caso este contraste não se dê de maneira satisfatória, pode ocorrer dificuldade no reconhecimento das estruturas).
Um ponto que vale ressaltar é a dificuldade de encontrar pacientes que se enquadrem na pesquisa, pois estes não devem fazer uso de fumo nem álcool, não ter restaurações em dentes anteriores e estar disponível a participar do estudo.
Foi observada diferença entre os grupos pesquisados demonstrando que o uso do agente clareador, peróxido de carbamida nas concentrações de 10 e 16% promovem aumento no número de micronúcleos nos pacientes submetidos ao clareamento dental caseiro.

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