CLONAGEM DA GLICOPROTEÍNA IV (gD) DE HERPESVIRUS BOVINO TIPO 5 EM SISTEMA DE EXPRESSÃO HETERÓLOGO Pichia pastoris.

 DUMMER, Luana Alves1; MORAES, Carina Martins1; ROCHA, Andréa da Silva Ramos1; CONCEIÇÃO, Fabricio Rochedo2; VIDOR, Telmo3; LEITE, Fábio Pereira Leivas4.

1Pós Graduação em Biotecnologia Agrícola - Centro de Biotecnologia – UFPel dummer@gmail.com
2Bolsista ProDoc Pós Graduação em Medicina Veterinária - Centro de Biotecnologia/Faculdade de Veterinária - UFPel; 3Laboratório de Virologia e Imunologia - Faculdade de Veterinária - UFPel; 4Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Instituto de Biologia/Centro de Biotecnologia - UFPel.
Campus Universitário – Universidade Federal de Pelotas. CEP 96010-900

INTRODUÇÃO
  
 	O Herpes Vírus Bovino tipo 5 (BHV-5), um Alphaherpesvirus integrante da Família Herpesviridae, é caracterizado por possuir DNA dupla-fita, envolver um complexo ciclo lítico e manter-se latente nos gânglios trigeminais de animais que resistem à infecção (Thiry et al., 2006). 
 Apesar da similaridade com o BHV-1, como morfologia do virion, efeito citopático em cultivo celular e propriedades antigênicas, o BHV-5 é classificado como um vírus distinto devido a diferenças no genoma, capacidade de replicação ativa  e estabelecimento de doenças no sistema nervoso central (Delhon et al., 2003). 
A infecção viral é atribuída a glicoproteínas presentes no envelope do vírus: glicoproteína C (gC), B e D. Esta última atua na fusão e penetração celular sendo a principal candidata a produção de vacinas de subunidade, uma vez que induz uma resposta imunológica celular forte e consistente. A produção da gD, visando à construção de vacinas de subunidades, entretanto, deve manter sua solubilidade, autenticidade imunogência e permitir uma produção a baixos custos (Babiuk, et al.; 1996 Zhu et al., 1997). 
O uso de leveduras como sistema de expressão de proteínas recombinantes apresenta importantes vantagens, pois combina propriedades eucarióticas, como as modificações pós-traducionais em proteínas (glicosilação e secreção), e procarióticas, sendo organismos unicelulares, haplóides, de fácil manipulação e que crescem a altas densidades em meios econômicos, produzindo uma grande quantidade de proteína recombinantes (Babiuk, et al., 1996; Zhu et al., 1997). A Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que têm sido amplamente empregada na produção de proteínas heterólogas por manter os pré-requisitos necessários à produção em larga escala (Cereghino & Cregg, 2000; Daly & Hearn, 2005). 
O objetivo deste trabalho foi a clonagem da gD de BHV-5 no vetor pPICZB de P. pastoris (Invitrogen), o qual confere estabilidade por ser integrativo além de ser induzível na presença de metanol como fonte única de Carbono, pois contém o gene da enzima Alcohol Oxidase (AOX1 e AOX2) (Daly & Hearn, 2005). 
  
METODOLOGIA
 
O DNA genômico do vírus BHV-5, gentilmente fornecido pelo Laboratório de Virologia da Universidade Federal de Santa Maria, foi obtido com a utilização de TRIzol Reagent (Invitrogen) e o gene foi amplificado pela Reação de Polimerase em Cadeia (PCR). Para o desenvolvimento do PCR utilizou-se 2% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) e 2l de DNA Molde. Os primers forward (5’ GGG GTA CCA AAT GTA CAT CGA GCC CTG GCA 3’) e reverse (5’ GCT CTA GAG TGG CGG GGG TGG GCG G 3’) foram desenhados, com auxílio do Software VectorNTI  8.0 (Informax, Inc.), de acordo com a seqüência disponível no GeneBank (NC 005261), visando à exclusão do peptídeo sinal presente no gene. Como controle do DNA molde utilizou-se primers para a gE de BHV-5 fornecidos pelo Laboratório de Virologia da UFSM.
O produto de PCR foi purificado com GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) e, assim como o vetor pPICZB, foram clivados com as enzimas de  restrição KpnI e XbaI (Invitrogen) por 2h a 37°C. Após cada digestão ambos foram purificados com o mesmo Kit citado anteriormente e unidos com a enzima DNAligase a 16°C. Antes da união, os vetores foram submetidos à ação da enzima CIP Fosfatase Alcalina. Células de Escherichia coli TOP10F foram semeadas em meio de cultivo Luria Bertani low salt (LB - low salt) e mantidas durante a noite em agitador orbital para o preparo de células competentes e transformação por eletroporação. As colônias recombinantes foram selecionadas em LB ágar contendo 25g/ml do antibiótico Zeocin (Invitrogen) e incubadas a 37°C por 48horas. 
Os clones obtidos foram selecionados com fenol clorofórmio (Jouglard et al., 2002), PCR e clivagem do DNA plasmidial com a enzima de restrição ApaI. Após a identificação dos clones, as colônias foram replicadas em LB (low salt) com 25g/ml Zeocin, mantidos durante a noite em agitador orbital – 250rpm a 37°C. Posteriormente, 5g de DNA plasmidial foram preparados pela técnica de extração MidiPreparation (Sambrook & Russel, 2001) e linearizados com a enzima de restrição PmeI (Invitrogen). As células competentes de P. pastoris cepa KM71H foram preparadas de acordo com o manual - EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen), e transformadas por eletroporação. As células recombinantes foram selecionadas em Yeast Extract Peptone Dextrose Agar Medium com Sorbitol (YPDS ágar) com 100g/ml de Zeocin (Invitrogen) e incubadas a 28°C por 72 horas. 
A seleção foi realizada por PCR utilizando-se primers para o gene da gD de BHV-5 e com os primers para o gene AOX1 presente no vetor. As colônias foram replicadas em placas de 96 cavidades com 2ml de YPD e 100g/ml de Zeocin (Invitrogen) e sofreram extração de DNA genômico através do Method of Rapid Isolation of Yeast DNA (Sambrook & Russel, 2001). 

RESULTADOS E DISCUSSÕES

	O gene da gD de BHV-5 foi amplificado após diversas tentativas que visaram à otimização da reação de PCR. O uso de 2% DMSO fez-se necessário uma vez que o genoma do BHV-5 possui 75% de pareamentos GC (Delhon et al., 2003). A temperatura de anelamento também teve que ser ajustada, sendo estabelecida em 67°C (Fig. 1). O produto obtido de PCR apresenta aproximadamente 1000pb. 

Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 0,8% demonstrando a amplificação por PCR do gene da gD de BHV-5: 1 - Marcador de massa molecular DNA Ladder 1Kb; 2-9 - o gene da gD apresentando aproximadamente 1kb; 10 - o gene da gE com aproximadamente 400pb. 

B

Os insertos (gene da gD amplificado por PCR) e o vetor pPICZB foram clivados pelas enzimas KpnI e XbaI (Fig. 2A). O uso destas enzimas criou extremidades coesivas em ambos, possibilitando a construção do vetor de clonagem (Fig. 2B).

A

Figura 2: A. Eletroforese em gel de agarose 0,8%. 1 - Marcador de massa molecular  HindIII; 2 e 3 – Inserto (gD BHV-5) clivado com KpnI e XbaI; 4 – Vetor pPICZB clivado e tratado com CIP Fosfatase Alcalina. B. Mapa do vetor pPICZB com o gene da gD de BHV-5. Cauda de Histidina após sítio de inserção do gene, facilitando identificação e purificação da proteína expressa em P. pastoris.

	A seleção através de Zeocin das células de E.coli TOP10F que sofreram eletroporação resultou em um grande número de colônias recombinantes. Doze colônias foram selecionadas, demonstrando a eficiência na transformação (Fig. 3A). Dos clones recombinantes, seis foram selecionados para PCR com os primers da gD de BHV-5, demonstrando a presença do gene no vetor (Fig. 3B), o que foi confirmado através da clivagem do DNA plasmidial extraído de um clone com a enzima de restrição ApaI, que possui três sítios de restrição no gene da gD de BHV-5, originando três fragmentos de 3727pb, 770pb e 16pb (não visível em gel de agarose 0,8%) (Fig. 3C).

   1        2       3        4       5       6        7       8        9       10    11     12       V      

A

         

Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 0,8%. A. 1-12 – Colônias de E.coli submetidas à seleção. As setas indicam colônias não recombinantes; V – Vetor não digerido. B. Amplificação por PCR de colônia do gene da gD de BHV-5: 1- Marcador de massa molecular DNA ladder 1Kb; 2-10 – Gene da gD apresentando aproximadamente 1kb. C. Resultado da clivagem com ApaI: 1 – Marcador de massa molecular DNA ladder 1kb; 2- Fragmentos originados. 

Um clone recombinante, identificado como pPICZB/gDBHV-5 (3) foi escolhido para extração de plasmídeo e posterior transformação em P. pastoris. As células transformadas foram plaqueadas em dois momentos: após uma hora em sorbitol (recuperação celular) em volumes de 100 e 200l e após 3 horas, quando o meio foi adicionado as células, em volumes equivalentes. Todas as placas apresentaram colônias resistentes a Zeocin. As colônias recombinantes foram semeadas em 2ml de YPD para garantir um estoque viável de células e possibilitar a extração de DNA genômico. Técnicas de PCR estão serão empregadas, com a utilização de dois conjuntos de primers (AOX e gDBHV-5). Até o presente não há resultados disponíveis da transformação em P. pastoris. Estudos estão sendo realizados com o objetivo de identificar colônias recombinantes. 
	 
CONCLUSÕES

	Os dados disponíveis até o presente momento sugerem que a utilização de P. pastoris para expressão de proteínas heterólogas de BHV-5 é uma alternativa para a produção de vacinas recombinantes. No entanto, experimentos seguirão sendo conduzidos, fornecendo informações necessárias para tal hipótese. 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CEREGHINO, J. L.; CREGG, J. M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiology Reviews, 2000, 24, p. 45-66.  
DALY, R.; HEARN, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein enginnering and production. Journal of Molecular Recongnition, 2005, 18, p. 119-138.
DELHON, G.; MORAES, M. P.; LU, Z.; AFONSO, C. L.; FLORES, E. F.; WIEBLEN, R.; KUTISH, G. F.; ROCK, D. L. Genome of Bovine Herpesvirus 5. Journal of Virology, 2003, 77, p: 10339-10347.
INVITROGEN. A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZ in Pichia pastoris. EasySelect Pichia Expression Kit, 2005. Version H. 
JOUGLARD, S.D.; MEDEIROS, M.A.; VAZ, E.K.; BASTOS, R. G.; DA CUNHA, C.W.; ARMOA, G.R.G.; DELLAGOSTIN, O.A. An Ultra-Rapid and Inexpensive Plasmid Preparation Method for Screening Recombinant Colonies. Abstracts American Society for Microbiology, 2002, H-71, p. 234.
SAMBROOK, J.; RUSSEL, D. W. Molecular Clonning: A Laboratory Manual. 2001, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Edição 3. Woodbury, New York EUA.
THIRY, E.; MUYLKENS, B.; MEURENS, F.; GOGEV, S.; THIRY, J.; VANDERPLASSCHEN, A.; SCHYNTS, F. Recombination in the alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1. Veterinary Microbiology, 2006, 113, p: 171-177.
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