CLONAGEM DO GENE fimA DE Salmonella Enteritidis PARA IMUNIZAÇÃO GENÉTICA VISANDO A PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS

MOREIRA, Ângela N. 1, 2; CONCEIÇÃO, Fabricio R.3, 5; CONCEIÇÃO, RITA de Cássia S. 4; DIAS, Clarice N. 1, 2; DELLAGOSTIN, Odir Antonio 5; CARVALHAL, José B. 2; ALEIXO, José Antonio G. 1, 2

1Laboratório de Imunologia Aplicada - CENBIOT/UFPel; 2Laboratório de Análises de Alimentos - Faculdade de Nutrição/UFPel; 3Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária - Faculdade de Veterinária/ UFPel; 4Laboratório de Inspeção de Leite - Faculdade de Veterinária/ UFPel; 5Laboratório de Biologia Molecular - CENBIOT/UFPel
Campus Universitário - Caixa Postal 354 - CEP 96010-900. angelanm@ufpel.edu.br

1. Introdução

A detecção de salmonelas em alimentos através da metodologia convencional baseia-se no isolamento destas bactérias em meios seletivos e posterior identificação bioquímica e sorológica. Devido a isto, esta metodologia requer um tempo relativamente longo para ser completada (4-7 dias) e apresenta custo operacional bastante elevado em função do material e da mão de obra envolvidos na execução das análises (FDA, 1992). Os métodos imunológicos são sensíveis, específicos e fáceis de executar e a utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) aumenta a especificidade destes métodos (Kerr et al., 1992, Valdivieso-Garcia et al., 2001). 
A produção de MAbs através de métodos de imunização clássicos muitas vezes é complicada, devido à necessidade de grandes quantidades de antígenos purificados para a imunização e a baixa expressão e/ou dificuldade de purificação de muitas proteínas em condições naturais (Puttikhunt et al., 2003). A imunização genética evita esses problemas, uma vez que o gene que codifica o antígeno de interesse é injetado nos animais e a proteína é expressa “in vivo” (Tang et al., 1992). Além disso, esta imunização gera respostas fortes, altamente específicas e os MAbs gerados reconhecem as formas nativa e recombinante da proteína (Leinonen et al., 2004; Puttikhunt et al., 2003). 
Neste trabalho é descrita a clonagem de gene que codifica um antígeno específico de salmonelas em um plasmídeo de expressão em eucariotos, visando a produção de MAbs através de imunização genética, e a clonagem do mesmo gene em um plasmídeo de expressão em E. coli, para utilização da proteína recombinante na triagem dos MAbs. 

2. Material e mÉtodos

2.1- Seleção do gene e desenho dos primers 
Genes específicos do gênero Salmonella, que codificam antígenos de superfície, foram selecionados através de uma extensa revisão bibliográfica e pesquisas em bancos de dados de DNA (GenBank e EMBL) visando a sua clonagem em plasmídeos de expressão em células eucarióticas para a produção de MAbs através de imunização genética. As seqüências dos genes pré-selecionados foram comparadas com as de salmonelas e de outras bactérias depositadas nos bancos de dados através de alinhamento com o programa BLAST N (National Center for Biotechnology Information - NCBI). Primers foram desenhados e avaliados com o auxílio do software Vector-NTI, para escolher aqueles com as melhores características. 

2.2- Clonagem nos vetores de expressão em eucariotos e procariotos
O gene foi amplificado por PCR a partir do DNA total de S. Enteritidis extraído conforme as instruções do Kit PureGene (Gentra Systems). Após, foi clonado nos plasmídeos de expressão em eucariotos (pcDNA3) e em E. coli (pAE). E. coli TOP 10 competente foi transformada por eletroporação com o pcDNA3/fimA e o pAE/fimA e as células recombinantes foram selecionadas em ágar LB contendo ampicilina. Para a extração dos DNAs plasmideais foi realizada uma lise alcalina. Os clones foram caracterizados através de digestão com enzimas de restrição (BamHI e EcoRI), PCR e seqüenciamento.

2.3- Expressão da proteína recombinante em E. coli
Cepas de E. coli competentes BL21 SI, pLYS e DE3 foram transformadas com pAE/fimA visando a expressão da proteína recombinante. As células recombinantes, selecionadas em ágar LB contendo ampicilina, foram cultivadas em meio 2YT-ON e incubadas em agitador orbital (300C/ 250rpm) até a fase log de crescimento. A expressão da proteína recombinante foi induzida com 300 mM de NaCl (para E. coli BL21 SI) ou com 1 mM de IPTG (para BL21 pLYS  e DE3). Duas, três e quatro horas após a indução, alíquotas de 1 ml da cultura foram coletadas e centrifugadas para confirmação da expressão da proteína recombinante através de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).       

3. Resultados e discussão

O gene fimA de Salmonella Enteritidis (número de acesso no GenBank S76043), que codifica a subunidade principal da fimbria tipo 1 de salmonelas,  foi o selecionado para clonagem, pois no alinhamento de DNA apresentou alta similaridade com regiões alvo de várias salmonelas, tais como Salmonella Typhimurium, Salmonella Paratyphi, Salmonella Pullorum, Salmonella Diarizone e Salmonella Typhi, e baixa similaridade com outras bactérias. O par de primers foi selecionado visando à amplificação do gene inteiro, para aumentar a chance da expressão da proteína em sua conformação tridimensional nativa e, assim, produzir MAbs que reconheçam a bactéria íntegra. Além disso, os primers foram desenhados visando a clonagem direcional do gene no plasmídeo e a geração, internamente aos sítios de restrição, de um códon de iniciação ATG e outro de terminação TAA nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente. O gene fimA foi amplificado por PCR e clonado nos vetores de expressão em eucariotos (pcDNA3) e em E. coli (pAE) gerando os plasmídios pcDNA3/fimA e pAE/fimA (Figura 1). A caracterização dos plasmídeos demonstrou que os insertos estavam na orientação correta, apresentando 100% de similaridade com o gene fimA de S. Enteritidis. Camundongos BALBc foram imunizados com pcDNA3/fimA visando a produção de MAbs contra a proteína FimA de salmonelas.
	
(a)

(b)

Figura 1. Clonagem do gene fimA nos plasmídeos de expressão em eucariotos (pcDNA3) e em E. coli (pAE).

	A expressão da proteína FimA (rFimA) recombinante foi avaliada em cepas de E. coli BL21 SI, pLYS e DE3 transformadas com pAE/fimA. Uma banda de aproximadamente 20,7 kDa, correspondente à rFimA, foi observada quando o gene fimA foi expresso em E. coli BL21 pLYS e DE3 após 2 h de indução (Figura 2). A proteína rFimA expressa em E. coli será utilizada na triagem dos MAbs. 

NI    2    3    NI   2    3    NI    2    3  MPM

-20 kDa

-50 kDa

   DE3             pLYS                    SI   

Figura 2. SDS-PAGE da expressão da rFimA em E. coli BL21 DE3, pLYS e SI após 2 e 3 horas de indução. NI: não induzida.

4. CONCLUSÕES

	O gene fimA, que codifica a subunidade principal da fimbria tipo especifica salmonelas, foi clonado com sucesso nos vetores de expressão em eucariotos e E. coli. Camundongos BALBc foram imunizados geneticamente com pcDNA3/fimA visando a prodição de MAbs anti-FimA de salmonelas. E. coli BL21 pLYS e DE3 expressaram eficientemente a proteína recombinante que será posteriorrmente utililizadas no triagem dos MAbs. 

    
5. Referências BIBLIOGRÁFICAS
 
FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8 th edn., Arlington, VA, AOAC. 1992.

KERR, S.; BALL, H.J.; MACKIE, D.P.; POLLOCK, D.A.; FINLAY, D.A. Diagnostic application of monoclonalantibodies to outer membrane protein fpr rapid detection of salmonella. Journal Applied Bacteriology, v. 72, p. 302-308, 1992.

LEINONEN, J.; NIEMELÃ, P.; LÖVGREN, J.; BOCCHI, L.; PETTERSSON, K.; NEVANLINNA, H.; STENMAN, U-H. Characterization of monoclonal antibodies against prostate specific antigen produced by genetic immunization. Journal of Immunological Methods, v. 289, p. 157-167, 2004.

PUTTIKHUNT, C.; KASINRERK, W.; SRISA-AD, S.; DUANGCHINDA, T.; SILAKATE, W.; MOONSOM, S.; SITTISOMBUT, N.; MALASIT, P. Production of anti-dengue NS1 monoclonal antibodies by DNA immunization. Journal of Virological Methods, v. 109, p. 55-61, 2003.

TANG, D.; DeVIT, M.; and JOHNSTON, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature, v. 356, p. 152-154, 1992. 

VALDIVIESO-GARCIA, A.; RICHIE, E.; ABUBAKAR, O.; WADDELL, T. E.; BROOKS, B. W. Adouble antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection pf Salmonella using biotinylated monoclonal antibodies. Diagnosis Microbiology and Infection Disease, v. 41, n. 3, p. 99-106, 2001.