CLONAGEM DIRECIONAL DE ANTÍGENOS SECRETADOS DE Mycoplasma hyopneumoniae EM pET200D-TOPO

GALLI, Vanessa1;  HARTWIG, Daiane1; SIMIONATTO, Simone1; LUERCE, Tessália Diniz1; POHL, Paula Cristiane2; DELLAGOSTIN, Odir Antônio1

1Laboratório de Biologia Molecular – CenBiot  – IB/UFPel
2Laboratório de Imunologia Aplicada à Sanidade Animal – Cbiot - UFRGS
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. vane.galli@bol.com.br

1. INTRODUÇÃO

A Pneumonia enzoótica suína (PES) causada pela bactéria Mycoplasma hyopneumoniae, é uma doença respiratória crônica que acomete aproximadamente 80% da criação de suínos (Fano et al, 2005). A infecção por M. hyopneumoniae é controlada com o uso de antibióticos e procedimentos de manejo animal, além da prevenção através da vacinação (Ross et al, 1986). A vacina disponível no mercado é composta por bacterina e apresenta elevado custo de produção, principalmente devido ao crescimento fastidioso deste agente (Chen et al, 2001). Além disso, a mesma não apresenta uma proteção satisfatória. Desta forma, estudos vêm sendo desenvolvidos na busca de novas alternativas para o controle desta infecção, uma vez que apresenta elevado impacto econômico, principalmente na região Sul do Brasil (Sobestiansky et al, 1999). 
Neste âmbito, o desenvolvimento de vacinas utilizando tecnologia de DNA recombinante torna-se uma alternativa viável (Kobisch et al, 1986;). Contudo, as novas estratégias de vacinação testadas até o momento apresentam apenas proteção parcial. Além disso, a presença de seqüências TGAs no genoma de Mycoplasma dificulta a clonagem de genes em sistemas heterólogos como E. coli, pois nestes geram um códon de terminação (Chen et al, 2003; Dybvig et al, 1996). 
Com o resultado do seqüenciamento da cepa 7448 (patogênica) realizado pela Rede Sul de Análise de Genomas e Biologia Estrutural (PIGs) foram identificadas 662 regiões codificadoras (CDS) de proteínas (Vasconcellos et al, 2005). Destas, 41 foram caracterizadas como proteínas secretadas, potencialmente antigênicas. Tendo em vista o pequeno número de antígenos de M. hyopneumoniae caracterizados até o momento, torna-se necessária a busca de novos alvos com potencial para utilização como vacinas e em testes de imunodiagnóstico. Desta forma, este trabalho teve por objetivo a clonagem direcional de genes que codificam proteínas secretadas de M. hyopneumoniae no vetor de expressão pET200D-TOPO. Os resultados gerados neste estudo possibilitarão a expressão e purificação de proteínas recombinantes em E. coli e sua posterior caracterização imunológica.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Seleção dos alvos
Tendo como base as CDs identificadas pelo seqüenciamento da cepa 7448, as 41 CDs de proteínas secretadas foram analisadas pelo programa Vector NTI 8.0 (Informax), atendendo aos seguintes critérios: maior tamanho em pares de bases (pb) da seqüência sem TGAs e hidrofobicidade da proteína.
2.2 Desenho dos primers e amplificação dos genes
Primers específicos para a amplificação dos genes foram desenhados com o auxílio do programa Vector NTI 8.0 (Informax). Foi adicionado aos primers forward uma seqüência de 4 pb (CACC), na porção 5´, a qual é complementar à seqüência GTGG presente no vetor pET200D-TOPO (Invitrogen), permitindo com isso a clonagem direcional dos genes amplificados. Estes foram amplificados com Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
2.3 Clonagem e transformação em E. coli
Os produtos de PCR foram quantificados e diluídos, utilizando-se 3 ng do produto de PCR para genes de até 1 kb e 5 ng para até 2 kb. A reação de clonagem foi realizada segundo especificações do fabricante do kit Champion® pET200D-TOPO (Invitrogen). Os vetores foram inseridos por eletroporação em células competentes frescas de E. coli Top10F. As culturas transformadas foram plaqueadas em meio Luria Bertani (LB) suplementado com canamicina 100 µg/mL e incubadas 37° C overnight. 
2.3. Triagem dos clones recombinantes
As colônias transformantes foram cultivadas em meio 2YT líquido acrescido de canamicina 100 µg/mL em placas de cultivo de 96 orifícios e incubadas 37° C overnight.  O DNA plasmidial foi extraído através de método microprep (Jouglard, et al 2002) e visualizado em gel de agarose 0,8%. A confirmação dos plasmídios recombinantes foi realizada através de digestão com as enzimas de restrição XbaI e HindIII. Os produtos gerados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose para visualização das bandas. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Através da análise dos 41 alvos que codificam proteínas secretadas de M. hyopneumoniae, realizada com o programa Vector NTI 8.0 (Informax), 28 foram selecionados para clonagem. Todos os genes selecionados foram amplificados por PCR e destes 25 foram clonados no vetor pET200D-TOPO, denotando sua alta eficiência (Tabela 1). O número de clones recombinantes obtidos de cada alvo clonado está especificado na Tabela 1. Fotos ilustrativas da amplificação, de alguns dos genes selecionados estão representados na Figura 1.

  1     2   3   4    5   6    7   8    9  10 11 12 13  14  15 16 17 18 19	   20   21   22   23   24    25   26   27   28   29   30   31   32  33	
						
Figura 1. Amplificação dos 28 alvos selecionados em gel de agarose 0,8%. Colunas 1 e 20- marcador 1 kb DNA Ladder; colunas 2 a 19 e 21 a 31- diferentes genes amplificados por PCR; coluna 32- controle positivo (plasmídio 0328); coluna 33- controle negativo (sem DNA).

Tabela 1. Relação dos 28 alvos selecionados, com seus respectivos tamanhos em pares de bases e os resultados obtidos quanto à amplificação e clonagem destes genes.
	Gene	Tamanho do gene	Amplificado	Clonado	Nº de clones recombinantes 	
1	Gi709N	732 pb	Sim	Sim	3	
2	Gi988N	1075 pb	Sim	Sim	1	
3	Gi709C	566 pb	Sim	Sim	4	
4	Gi611C	873 pb	Sim	Sim	2	
5	Gi651	363 pb	Sim	Sim	7	
6	Gi675N	566 pb	Sim	Sim	3	
7	Gi948C	543 pb	Sim	Sim	1	
8	Gi448N	1260 pb	Sim	Sim	2	
9	Gi987N	1200 pb	Sim	Não	0	
10	Gi611N	1460 pb	Sim	Não	0	
11	Gi765N	1128 pb	Sim	Sim	2	
12	Gi940C	582 pb	Sim	Sim	3	
13	Gi703C	865 pb	Sim	Sim	3	
14	Gi703N	549 pb	Sim	Sim	4	
15	Gi692	577 pb 	Sim	Sim	4	
16	Gi800	1047pb	Sim	Sim	1	
17	Gi869	735 pb	Sim	Sim	4	
18	Gi742	1002 pb	Sim	Sim	1	
19	Gi702	855 pb	Sim	Sim	1	
20	Gi793	750 pb	Sim	Sim	2	
21	Gi908	597 pb	Sim	Sim	5	
22	Gi940N	582 pb	Sim	Sim	2	
23	Gi452	1128 pb	Sim	Sim	5	
24	Gi691	837 pb	Sim	Sim	6	
25	Gi733	456 pb	Sim	Sim	1	
26	Gi447N	1047 pb	Sim	Sim	6	
27	Gi447C	928 pb	Sim	Não	0	
28	Gi573	1005 pb	Sim	Sim	4	
A identificação preliminar dos clones recombinantes foi realizada através do método microprep, conforme observamos na Figura 2. Nesta, foram considerados clones recombinantes os que apresentavam banda mais alta que a banda indicada pelo vetor não recombinante, sugerindo, desta forma, a presença do inserto, como é o caso dos clones representados nas colunas 5 e 9 da Figura 2.  A digestão dos vetores está exemplificada na figura 3. Neste caso, foram considerados os tamanhos das bandas individualmente para cada clone, levando em consideração o tamanho do inserto, a localização dos sítios de restrição no vetor para as enzimas utilizadas e o fato de que, do sítio XbaI até a seqüência CACC há 146 pb e que, de CACC até o sítio de restrição para HindIII há 314 pb. Desta forma, os clones considerados não recombinantes apresentaram banda de aproximadamente 500 pb.

      A     1    2   3   4   5   6   7   8   9  10	         B

Figura 2. A. Eletroforese em gel de agarose representativo da triagem dos clones recombinantes de alguns dos alvos selecionados. Coluna 1- marcador 1 kb; Colunas 5 e 9- prováveis clones recombinantes; Colunas 2, 3, 4, 6, 7, 8 e 10- clones considerados não recombinantes. A seta aponta a banda referente ao vetor não recombinante. B. Foto exemplificativa da digestão dos alvos. A seta indica a banda de 500 pb. 

Estes alvos clonados serão expressos em E. coli, purificados e testados quanto sua antigenicidade e imunogenicidade visando o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra pneumonia enzoótica suína.

4. CONLUSÃO

Com base nos resultados obtidos, conclui-se que a estratégia de clonagem direcional no vetor de expressão em E. coli pET200/TOPO foi eficiente uma vez que possibilitou a clonagem de um elevado número de genes de M. hyopneumoniae. Esta metodologia permitiu a obtenção de plasmídios recombinantes os quais serão utilizados para expressão das proteínas de M. hyopneumoniae em E. coli. 

       5. REFERÊNCIAS

1-	CHEN, J.R.; LIAO, C.W.; MAO, C.N.W. A recombinant chimere composed of repeat region RR1 of Mycoplasma hyopneumoniae adhesin with Pseudomonas exotoxin: in vivo evaluation of specific IgG response in mice and pigs. Vet. Microbiol., 2001, v.80, p.347-357.
2-	CHEN, Y. L., WANG, S. N., YANG, W. J., CHEN, Y. J., LIN, H.H., SHIUAN D. Expression and Immunogenicity of Mycoplasma hyopneumoniae Heat Shock Protein Antigen P42 by DNA Vaccination. Infection and Immunity, 2003, v.71, n.3., p.1155-1160.
3-	FANO, E.; PIJOAN, C.; DEE, S. Dynamics and persistence of Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs. Can J Res., 2005, v.69, n.3, p.223-228.
4-	Jouglard, S. D.; Medeiros, M. A.; Vaz, E. K.; Bastos, R. G.; Cunha, C. W.; Armoa, G. R. G.; Dellagostin, O. A. An Ultra-Rapid and Inexpensive Plasmid Preparation Method for Screening Recombinant Colonies. Abstracts American Society for Microbiology, 2002, H 71, p.234.
5-	KOBISCH, M. AND FRIIS, N.F. Swine mycoplasmoses. Res. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1996, v.15, p. 1569–1605. 
6-	ROSS, R.F., LEMAN, A.D., STRAW, B., GLOCK, R. D., MENGELING, W.L., PENNY, R.H.C., SCHOLL, E. Diseases of Swine. Mycoplasma disease. The Iowa State University Press, Ames, IA, 1986, p. 469–483.
7-	SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D.; MORES, N. Pneumonia enzoótica. Clínica e Patologia Suína, 2ª ed., Art 3 Impressos Especiais, Goiânia, Goiás, 1999, p.359.
8-	DYBVIG, K.; VOELKER, L.L. Molecular biology of Mycoplasmas. Annual Review of Microbiology. 1996, v. 50, p. 25-27. 
9-	VASCONCELOS, A.T.R.; FERREIRA, H.B.; BIZARRO, C.V. Swine and Poultry Pathogens: the Complete Genome Sequences of Two Strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a Strain of Mycoplasma synoviae. Journal of Bacteriology. 2005, v.187, n.16, p. 5568-5577.