Title: AVALIAÇÃO IN SILICO DE REGIÕES GENÔMICAS CONSERVADAS PARA O GENE DA LEPTINA PARA IDENTIFICAR SEQÜÊNCIAS ALVOS
Author: Paulo Varoni Cavalcanti
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ESTUDO IN SILICO DE REGIÕES GENÔMICAS CONSERVADAS PARA CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE DA LEPTINA DE Paralichthys orbignyanus

CAVALCANTI, Paulo Varoni^1,2; CAMPOS, Vinicius Farias^1,2; KAEFER, Cristian^1; SILVA, Evelise Sampaio; AMARAL, Marta Gonçalves^1; DESCHAMPS, João Carlos^1,2; SEIXAS, Fabiana Kömmling^1; COLLARES, Tiago^1,2; SAMPAIO, Luis André^3; ROBALDO, Ricardo Berteaux^2

^1Universidade Federal de Pelotas
^1Centro de Biotecnologia
^1Laboratório de Biotécnicas da Reprodução Animal
^1Grupo de Embriologia Molecular e Transgênese Animal
^2Grupo de Fisiologia Aplicada à Aqüicultura
^3Estação Marinha de Aqüacultura
E-mail: pcavalcanti_fv@ufpel.edu.br
Web: www.ufpel.edu.br/cenbiot/emta

1.	INTRODUÇÃO

Uma das espécies nativas apontadas como potencialmente exploráveis na Região sul do Brasil, é o linguado (Paralichthys orbignyanus). Este peixe apresenta ocorrência abundante no estuário da Lagoa dos Patos e região costeira adjacente e distribui-se desde o litoral do Estado do Rio de Janeiro até Mar del Plata na Argentina. Os primeiros estudos sobre a biologia e a potencialidade do Paralichthys orbignyanus na piscicultura abordaram a ampla tolerância da espécie a diversos parâmetros físico-químicos (Wasielesky et al., 1994; Wasielesky et al., 1997; Wasielesky et al., 1998); principalmente quanto à variação de salinidade e osmorregulação (Sampaio, 1999; Sampaio et al., 2002). Acredita-se que controle desse processo de adaptabilidade está sobre a influencia da leptina, um hormômio glicoprotéico que exerce efeitos estimulatórios sobre a liberação de somatolactina. O possível papel que este hormônio possa desenvolver sobre a manipulação do crescimento e tempo de maturação sexual, tem acentuado o interesse pelos estudos deste na aqüicultura (Company et al., 2001; Peyon et al., 2001). A leptina foi primeiramente descrita em tecido adiposo de camundongos obesos ob/ob em Zhang et al. (1994). Este hormônio age sobre o sistema nervoso regulando o peso corporal, influenciando a deposição de gordura através do controle do apetite, gasto de energia e do desempenho reprodutivo, apontado como hormônio envolvido no processo de puberdade de vários grupos de vertebrados (Doyon et al., 2001; Brann et al., 2002; Smith et al., 2002). Sua relação com a condição de reservas endógenas e seu possível papel na sinalização para o direcionamento da energia gasta no crescimento somático para o desenvolvimento gonadal, é de grande interesse nos estudos de fisiologia e aqüicultura. 
Algumas espécies de peixes, como os linguados do gênero Paralichthys sp. apresentam dimorfismo sexual quanto à taxa de crescimento em juvenis. As fêmeas, antes da puberdade crescem duas ou mais vezes mais rápido do que os machos (Specker & Chandlee, 2003). Existem fortes evidências, que a leptina possa indiretamente atuar nos processos de crescimento pelo controle da secreção da somatolactina e também estar envolvida na adaptabilidade à condições de estresse (Peyon et al., 2003).  Neste sentido, ferramentas de bioinformática e biologia molecular têm auxiliado significativamente na busca de respostas para o entendimento de determinados mecanismos ferramenta computacional para auxiliar à biologia molecular, pois possibilitam a construção virtual de processos biológicos, resultando em menores gastos laboratoriais e estimativas de resultados em menor tempo. fisiológicos. Especialmente estudos in silico surgem como expressivas ferramentas computacionais para auxiliar a biologia molecular, pois possibilitam a construção virtual de processos biológicos, resultando em menores gastos laboratoriais e estimativas de resultados em menor tempo.
Este estudo teve como objetivo buscar seqüências conservadas da região codificadora do gene da leptina de diversas espécies de vertebrados, para a construção de primers, com base na homologia entre os genes, possibilitando a obtenção do cassete gênico da leptina de linguado, visto que não há nenhuma ocorrência no banco mundial de genes referente à seqüência da leptina desta espécie.

2.	MATERIAIS E MÉTODOS

Para a obtenção das seqüências gênicas da leptina de diversas espécies de vertebrados, uma busca ao banco mundial de genes (GenBank) foi realizada. Estas seqüências foram inseridas no programa Vector NTI 10 (Invitrogen, Carlsbad, USA) e posteriormente, foram alinhadas utilizando a função AlingX do programa. Simultaneamente, foi realizada uma busca ao banco dados de informações taxonômicas do NCBI (National Center of Biotecnology Information) para a classificação taxonômica das espécies utilizadas. Através das informações taxonômicas, foi realizado um novo alinhamento contendo apenas seqüências gênicas da leptina de espécies de peixes taxonomicamente próximas ao linguado. A partir da homologia entre as seqüências, foram desenhados primers nas regiões conservadas. A fita consensus, resultante do alinhamento das seqüências de espécies de peixes, foi utilizada para a construção in silico do vetor recombinante de expressão em Escherichia coli, pAE-Lep. 

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram obtidas 23 seqüências dentre completas e parciais para a região codificadora do gene da leptina, durante a consulta ao banco mundial de genes, sendo 10 seqüências de mamíferos e 13 de peixes.  O resultado do alinhamento de todas as seqüências obtidas evidenciou que o gene da leptina apresenta homologia variável entre as espécies. Para agrupar as seqüências, foi realizada uma consulta taxonômica. A partir das informações taxonômicas das espécies utilizadas,foi realizado um segundo alinhamento contendo apenas espécies de peixes filogeneticamente próximas ao linguado. Podemos observar na Figura 1 as seqüências alinhadas, evidenciando o alto grau de homologia entre elas (amarelo).  A fita consensus foi utilizada para a construção de um par de primers específicos para a amplificação da região codificadora do gene da leptina de peixes, Figura 2 (as seqüências dos primers não serão divulgadas devida a potencial submissão de pedido de patente, ao qual este trabalho faz parte). Foi adicionado aos primers seqüências para criar sítios de restrição e permitir a construção do vetor recombinante pAE/Lep, para a expressão da leptina em E. coli (Figura 3).  

Figura 1 - Seqüências de peixes alinhadas (seqüências homólogas em amarelo e seqüências discordantes em azul).

Figura 2 – Seqüência consensus do gene da leptina de peixes (seta laranja) e primers (setas verdes).

Figura 3 – Vetor recombinante pAE/Lep.

4.	CONCLUSÕES

A utilização de ferramentas de bioinformática possibilitam o desenvolvimento de estratégias alternativas para a obtenção de seqüências ainda não conhecidas, com baixo custo. Simulações in silico podem ser utilizadas para prospectar resultados antes de sua execução. Assim, este estudo possibilitou o desenho de primers para a amplificação e clonagem do gene da leptina de linguado, mesmo não havendo depósito no GenBank para a seqüência da leptina desta espécie. Através deste conjunto de primers é possível obter o gene da leptina de linguado a partir do genoma (éxons e íntrons) do animal, bem como de bibliotecas de cDNA obtidas por extração de mRNA.

5.	REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS

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