COMPARAÇÃO IN SILICO ENTRE GENOMAS MITOCONDRIAS (mtDNA) DE Struthio camelus E Rhea americana 
 
COLLARES, Tiago.1,3; CAMPOS, Vinicius Farias1,3; CAVALCANTI, Paulo Varoni1,3; KAEFER, Cristian1; SILVA, Evelise Sampaio1; TAVARES, Rafael A. 1, AMARAL, Marta Gonçalves1; COLLARES, Gilberto Loguercio2,3; DESCHAMPS, João Carlos1,3; 

1Centro de Biotecnologia - UFPel
1Grupo de Embriologia Molecular e Transgênese Animal (CenBiot)
2Colégio Agrícola Visconde da Graça - UFPel
3Grupo de Pesquisa CAVGema (CAVG – CenBiot)
1,2Universidade Federal de Pelotas 
 Campus Universitário s/n Caixa Postal 354 – CEP 96010-900/RS
E-mail: tcollares.cbiotec@ufpel.edu.br
Web: www.ufpel.edu.br/cenbiot/emta

1.	INTRODUÇÃO

Como resultados da atividade humana, declínios significativos na distribuição e abundância de diversas espécies têm aumentado seu risco de extinção global (Brooks et al., 2006). A Rhea americana (ema) e a Struthio camelus (avestruz), representam críticos modelos de organismos para estudar os efeitos potenciais da fragmentação e isolamento reprodutivo na diversidade genética de populações naturais que têm sido afetadas significativamente pelas atividades humanas e pela criação artificial descontrolada (Bouzat, 2001; Barri et al., 2005).
 A divergência genética evolutiva entre estas espécies de strutioniformes, foi datada molecularmente em aproximadamente 51 milhões de anos. Atualmente, estas espécies estão classificadas em Rheiformes (Emas) e Strutioniformes (Avestruz), segundo taxonomia molecular do GenBank. No entanto, a pressão de seleção artificial realizada em populações destas espécies sinaliza a perda da variabilidade genética, colocando estas populações em risco (Härlid et al., 1998).   
Ferramentas de biologia molecular e bioinformática têm auxiliado aos estudos que envolvem conservação de recursos genéticos, remodelagem filogenética, avaliação da dispersão gênica e busca de marcação genômica (Rossi & Martella, 2006). Os projetos de seqüenciamento genômico e de mtDNA têm promovido uma série de informações relevantes sobre o conhecimento das seqüências gênicas de diversas espécies (Janke et al., 1994; Janke & Arnason, 1997). Informações depositadas nos bancos de genes sobre genomas de Rhea americana e Struthio camelus ainda são tímidas quando comparadas a outras espécies. Soma-se a isso a carência de avaliação e interpretação in silico dos dados gerados a partir de projetos de seqüenciamento genômico.
Este estudo teve como objetivo comparar in silico os genomas mitocondriais (mtDNA) depositados no GenBank de Rhea americana e a Struthio camelus, buscando identidade entre 12 CDS (NADH, CO, ATPases e citocromo b), 12S rRNA, 16S rRNA e 22 tRNAs.

2.	MATERIAIS E MÉTODOS

Para a obtenção das seqüências gênicas mtDNA de Rhea americana e de Struthio camelus, foi realizada uma busca no banco mundial de genes (GenBank). Estas seqüências foram inseridas no programa Vector NTI 10 (Invitrogen®, Carlsbad, USA). Foram construídas moléculas virtuais no software com a descrição detalhada de todos os genes mitocondriais de cada espécie (Figura 1). As seqüências foram alinhadas utilizando a função AlingX do programa para buscar identidade entre os mtDNAs. Foram realizados alinhamentos individuais, gene a gene, para identificar homologias entre as seqüências gênicas entre 13 CDS (NADH, CO, ATPases e citocromo b), 12S rRNA,  16S rRNA e 22 tRNAs. 

Figura 1 - Genomas mitocondriais (mtDNA) de Rhea americana e a  Struthio camelus, representados por moléculas construídas no Vector NTI 10 (Invitrogen®, Carlsbad, USA). É importante observar o tamanho total dos genomas em pares de bases, ao centro da figura.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

A identidade geral, obtida entre os genomas mitocondriais, foi de 80,6% dentre os nucleotídeos correspondentes. Na Tabela 1, pode ser observado a distribuição dos RNAs e regiões codificadoras dos genomas mitocondriais dee ambas as espécies. As porcentagens de identidade entre as seqüências estão dispostas individualmente. A identidade obtida para 12S rRNA e 16S rRNA foi de 87,9 e 85,7%, respectivamente. Estes dados sugerem uma proximidade genética evolutiva muito grande entre as espécies, porém deixando uma margem significativa de variabilidade genética para estudos de dispersão gênica de determinadas mutações. Dentre as regiões codificadoras (CDS) destaca-se a citocromo b, devido sua relevância na utilização em estudos de taxonomia molecular (Krajewski & King, 1996). Nos alinhamentos mitocondriais obtidos para esta região, observou-se identidade de 83,4%. 

Tabela 1. Distribuição da localização das seqüências genômicas (mtDNA) de Rhea americana e a Struthio camelus, demonstrando os tamanhos dos fragmentos em pares de bases (pb) e a identidade avaliada in silico.

	Struthio camelus	Rhea americana		
	Início	Final	Fragmento (pb)	Início	Final	Fragmento (pb)	Identidade %	
rRNAs		
12S rRNA	70	1035	965	69	1031	962	87,9	
16S rRNA	1104	2682	1578	1103	2685	1582	85,7	
CDS		
NADH1	2766	3740	974	2771	3745	974	78,9	
NADH2	3960	5000	1040	3978	5018	1040	78,1	
COI	5358	6908	1550	5374	6924	1550	83,5	
COII	7047	7734	687	7061	7747	686	84,5	
ATPase 8	7804	7971	167	7818	7985	167	77,7	
ATPase 6	7962	8645	683	7976	8659	683	82,2	
COIII	8645	9428	783	8659	9441	782	81,8	
NADH3	9498	9704	206	9512	9863	351	85,4	
NADH4L	9920	10216	296	9934	10230	296	80,5	
NADH4	10210	11586	1376	10224	11600	1376	79,5	
NADH5	11794	13611	1817	11808	13625	1817	81,1	
CITOCROMO b	13621	14760	1139	13638	14777	1139	83,4	
NADH6	14968	15489	521	14947	15471	524	75,5	
tRNAs		
tRNA  Phe	1	69	68	1	68	67	82,4	
tRNA  Val	1036	1103	67	1032	1102	70	81,9	
tRNA  Leu-(UUR)	2683	2756	73	2686	2759	73	89,5	
tRNA  lle	3739	3809	70	3754	3824	70	78,3	
tRNA Gln	3821	3891	70	3839	3909	70	83,3	
tRNA Met	3891	3959	68	3909	3977	68	95,7	
tRNA Trp	4999	5072	73	5017	5087	70	82,7	
tRNA Ala	5073	5141	68	5089	5157	68	94,2	
tRNA Asn	5146	5218	72	5160	5232	72	85,2	
tRNA Cys	5220	5286	66	5236	5302	66	76,9	
tRNA Tyr	5286	5356	70	5302	5372	70	90,1	
tRNA Ser (UCN)	6900	6973	73	6916	6988	72	86,5	
tRNA Asp	6977	7045	68	6991	7059	68	87,0	
tRNA Lys	7735	7802	67	7749	7816	67	84,6	
tRNA Gly	9429	9497	68	9443	9511	68	92,4	
tRNA Arg	9851	9919	68	9866	9933	67	85,1	
tRNA His	11588	11657	69	11602	11671	69	86,8	
tRNA Ser (AGY)	11659	11722	63	11672	11737	65	96,9	
tRNA Leu-(CUN))	11723	11793	70	11737	11807	70	94,4	
tRNA Thr	14763	14832	69	14783	14852	69	84,4	
tRNA Pro	14888	14957	69	14862	14931	69	79,5	
tRNA Glu	15493	15560	67	15475	15543	68	64,3	

	
Em relação aos tRNAs foi possível observar que os fragmentos estão dispersos em ambos os genomas mitocondriais e, embora presentes em regiões genômicas semelhantes e apresentando fragmentos gênicos muito próximos em relação ao números de bases, apresentaram identidade bastante variada, permitindo inferir que existe uma pressão genética em relação as seqüências tRNAs. 

4.	CONCLUSÕES

As informações geradas a partir deste estudo permitiram a criação de estratégias para abordagem molecular subseqüente da variabilidade genética de Rhea americana. Informações genômicas desta espécie ainda são tímidas nos bancos de dados genômicos mundiais. Neste sentido, a busca de identidade genômica entre espécies evolutivamente próximas, permite o avanço em estudos genômicos de espécies selvagens.

5.	REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS

BARRI, F.R., NAVARRO, J.L., MACEIRA, N.O., MARTELLA, M.B. Rearing greater rhea (Rhea americana) chicks: is adoption more effective than the artificial intensive system? Br Poultry Science, 2005, v.46, p.22-25. 

BOUZAT, J.L. The population genetic structure of the Greater Rhea (Rhea Americana) in an agricultural landscape. Biological Conservation, 2001, v. 99, p. 277-284.

BROOKS, J.S., FRANZEN, M.A., HOLMES, C.M., GROTE, M.N., MULDER, M.B. Testing hypotheses for the success of different conservation strategies. Conservation Biology, 2006, v.20, p.1528-1538. 

HÄRLID, A., JANKE, A., ARNASON, U. The Complete Mitochondrial Genome of Rhea americana and Early Avian Divergences. Journal Molecular Evolution, 1998, v. 46, p.669–679.

JANKE, A., ARNASON, U. The complete mitochondrial genome of Alligator mississippiensis and the separation between recent archosauria (birds and crocodiles). Molecular Biology and Evolution, 1997, v.14, p.1266–1272.

JANKE, A., FELDMAIER-FUCHS, G., THOMAS, W.K., VON HAESELER, A. The marsupial mitochondrial genome and the evolution of placental mammals. Genetics, 1994, v.137, p. 243–256.

KRAJEWSKI, C., KING, D.G. Molecular divergence and phylogeny: rates and patterns of cytochrome b evolution in cranes. Molecular Biology and Evolution, 1996, v.13, p. 21–30.

ROSSI, F.H.J., MARTELLA, M.B. DNA test to sex the lesser rhea (Rhea pennata pennata). Br Poultry Science, 2006, v.47, p.375-377.