CLONAGEM DE FRAGMENTOS GÊNICOS DO PROMOTOR CRISP-1 PARA AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO EXÓGENA EM CÉLULAS DO EPIDÍDIMO DE CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS 

SILVA, Evelise Sampaio1; CAMPOS, Vinicius Farias1; CAVALCANTI, Paulo Varoni1; TAVARES, Rafael A.1; KAEFER, Cristian1; SEIXAS, Fabiana Kömmling1; AMARAL, Marta Gonçalves1; DESCHAMPS, João Carlos1; COLLARES, Tiago1. 

 1Grupo de Pesquisa em Embriologia Molecular e Transgênese Animal - EMTA
Laboratório de Biotécnicas da Reprodução
Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas 
 Campus Universitário s/n Caixa Postal 354 – CEP 96010-900/RS
E-mail: esilva_ib@ufpel.edu.br  
Web: www.ufpel.edu.br/cenbiot/emta

1. INTRODUÇÃO

Para o desenvolvimento de fármacos recombinantes, a biotecnologia vem utilizando modelos de animais que são gerados em larga escala e com um menor custo para a produção de proteínas de interesse (Houdebine, 2000; Keefer, 2004; Kues & Niemann, 2004). Teoricamente, qualquer fluido corporal destes animais é um potencial produtor das moléculas sintéticas de interesse como, por exemplo, o leite, a clara e gema de ovos, a urina, o sangue e o sêmen (Houdebine, 2000; Dyck et al., 2003; Collares et al., 2005). 
As células espermáticas testiculares não apresentam motilidade e não são capazes de se ligar ou fusionar com o oócito. Em mamíferos, a motilidade espermática e a capacidade de fusão são atingidas somente após alcançar a cauda do epidídimo, onde estas células são estocadas para ejaculação. O epidídimo é um órgão de secreção ativa, que de forma dinâmica altera a composição fluído-luminal (Robaire and Hermo, 1988). A secreção de diversas proteínas em regiões específicas do epidídimo tem sido descritas (Garrett et al., 1991). Estas mudanças no fluído luminal do epidídimo afetam a membrana plasmática dos espermatozóides, especialmente a composição protéica. Uma das principais famílias polipeptídicas secretados por este tecido é a CRISP (Cysteine Rich Secreted Proteins). Através das seqüências de aminoácidos é possível caracterizar a CRISP em CRISP-1, CRISP-2 e CRISP-3, sendo derivadas da expressão de distintos genes.  A expressão da CRISP-2 está restrita aos testículos. A CRISP-3, é expressa primariamente, em glândulas submandibulares, vesícula seminal e próstata (Haendler et al., 1993; Kratzschmar et al., 1996; Schambony et al., 1998). Já a expressão do gene CRISP-1, ocorre no epidídimo de mamíferos, sendo regulado por andrógenos (Klemme et al., 1999).
Os promotores gênicos, regiões genômicas que controlam e direcionam a expressão gênica a tecidos específicos, têm sido alvos de estudos em terapia gênica e transgênese animal (Cheng et al., 2003). Neste sentido, objetivou-se amplificar distintas regiões gênicas do promotor CRISP-1 para clonagem em vetores de expressão em células eucarióticas contendo o gene repórter EGFP. Pretende-se utilizar estes cassetes gênicos na geração de camundongos transgênicos que expressem no plasma seminal a proteína fluorescente.  

2. Material e Métodos

As amostras para extração de DNA genômico do sangue de Mus musculus, foram obtidas de exemplares pertencentes ao Núcleo de Experimentação em Transgênese (NET) do Centro de Biotecnologia da UFPel.  Foi utilizado para extração e purificação o kit comercial Purelink Genomic DNA purification (Invitrogen®). Foram utilizadas informações de depósito disponíveis no GenBank (acesso No.Y09162) e com o auxílio do programa de computador VectorNTI 9.0 (Invitrogen®) (Figura 1), foram desenhados primers para aplificar 3 regiões distintas do promotor gênico. Os fragmentos esperados para amplificação são CRISP-1a (1240pb), CRISP-1b (2477pb) e CRISP-1c (3685pb). Aos primers foward foi acrescentado o sítio para a enzima de restrição XhoI e ao primer reverse o sítio para a enzima BamHI. A reação foi submetida a uma temperatura de anelamento de 58°C. As seqüências do promotor gênico CRISP-1 foram amplificadas por PCR utilizando Recombinant DNA Polymerase (Invitrogen®). Após a PCR, os fragmentos amplificados foram purificados através do ‘GFX DNA Kit’ (Amershan Pharmacia Biotech®), digeridos com as enzimas de restrição XhoI e BamHI, purificados com o mesmo kit e ligado com T4 DNA Ligase (Invitrogen®) ao vetor de expressão pZsGreen (Clontech) (Figura 2), previamente digerido com as enzimas XhoI e BamHI e purificado utilizando o mesmo kit comercial. Após transformação em E. coli TOP10, clones recombinantes foram identificados e cultivados em meio líquido. O DNA plasmidial extraído destes clones foi digerido com as enzimas de restrição XhoI e BamHI para confirmação da presença do inserto.

Figura 1. Desenho esquemático do promotor gênico CRISP-1 de Mus musculus com as regiões a serem amplificadas.

Figura 2. Vetor comercial pZsGreen (Clontech®) para clonagem de promotores gênicos de expressão em células eucarióticas.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Construção dos vetores recombinantes  pZsGreenCRISP-1a, 1b e 1c

Os primers utilizados amplificaram as 3 seqüências alvo esperadas (1240pb, 2477pb e 3685pb). Os clones recombinantes foram identificados e cultivados em meio líquido. Os vetores recombinantes foram extraídos em larga escala, sendo confirmado, através das enzimas de restrição, a presença dos insertos. As amostras com inserto CRISP-1a apresentaram um fragmento de aproximadamente 1240pb e outro de aproximadamente 4.1kb. As amostras para CRISP-1b e CRISP-1c apresentaram um fragmento de aproximadamente 2477pb e 3685pb, respectivamente, e outro de aproximadamente 4.1kb, referente ao pZsGreen. Estas digestões confirmaram o sucesso da construção. Os vetores construídos foram denominados de pZsGreenCRISP-1a, pZsGreenCRISP-1b e pZsGreenCRISP-1c.  

B

Figura 2. Extração em larga escala dos vetores recombinantes contendo o promotor gênico CRISP-1 de Mus musculus utilizando GFX DNA Kit’ (Amershan Pharmacia Biotech®). Painel A demonstrando os vetores pZsGreenCRISP-1a e pZsGreenCRISP-1b. O painel B demonstrar repetições da purificação do vetor pZsGreenCRISP-1c.

4. CONCLUSÕES

Este estudo atingiu o objetivo de gerar em larga escala os vetores recombinantes contendo fragmentos parciais e totais do promotor gênico CRISP-1, sendo denominados de pZsGreenCRISP-1a, pZsGreenCRISP-1b e pZsGreenCRISP-1c. As regiões clonadas e fusionadas ao gene repórter EGFP do vetor comercial pZsGreen permitirão identificar o grau de expressão do promotor em tecidos alvos de camundongos transgênicos biorreatores. Espera-se que estes vetores dirijam a expressão gênica ao epidídimo dos animais geneticamente modificados, na próxima etapa deste trabalho. 

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA

CHENG, C. K., CHEEUNG, C. H., LEE, W. M. 2 Mouse Testin: Complementary DNA Cloning, Genomic Organization, and Characterization of Its Proximal Promoter Region1. Biology of Reproduction, 2003, v.68, p. 1376–1386. 

COLLARES, T., BONGALHARDO, D. C., DESCHAMPS, J. C., MOREIRA, H. L. M. Transgenic animals: The melding of molecular biology and animal reproduction Animal Reproduction., 2005, v.2, p.11-27.

HOUDEBINE, L. M. Transgenic animal bioreactores. Transgenic Research, 2000, v.9, p.305-320.

KEEFER, C. L. Production of bioproducts through the use of transgenic animal models. Animal Reproduction Science, 2004, v.82, p. 5–12.

KLEMME L. M., ROBERTS K. P., HOFFMAN L. B., ENSRUD K. M., SIITERI J. E., HAMILTON D. W. Cloning and characterization of the rat Crisp-1 gene. Gene, 1999, v.240, p. 279–288.

KUES, W. and NIEMANN, H. The contribution of farm animals to human health. Trends in biotechnology, 2004, v.22, p.6. 

ROBAIRE, B., HERMO, L., 1988. Efferent ducts, epididymis, and vas deferens: structure, functions, and their regulation. In: The Knobil, E., Neal, J.et al., (Eds.), Physiology of Reproduction. Raven Press, New York, pp. 999–1080.

GARRETT, S.H., GARRETT, J.E., DOUGLASS, J., 1991. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididy mis. Molecular. Reproduction and Development. V.30, p., 117.

HAENDLER, B., KRATZSCHMAR, J., THEURING, F., SCHLEUNING, W.D., 1993. Transcripts for cysteine-rich secretory protein-1 (CRISP-1, DE/AEG) and the novel related CRISP-3 are expressed under androgen control in the mouse salivary gland. Endocrinology, v.133, p.192–198.