CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E IN SILICO DE BANDAS PROTÉICAS DO PLASMA SEMINAL DE Gallus gallus 

KAEFER, Cristian1; CAMPOS, Vinícius F. 1; SILVA, Evelise Sampaio1; CAVALCANTI, Paulo V. 1; TAVARES, Rafael A.1van der LAAN, Guilherme M. 1; MIRANDA, Rossana C.; BONGALHARDO, Denise C. 1; AMARAL, Marta G. 1; DESCHAMPS, João Carlos1; COLLARES, Tiago1. 

1Grupo de Pesquisa em Embriologia Molecular e Transgênese Animal - EMTA
Laboratório de Biotécnicas da Reprodução
Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas 
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1. INTRODUÇÃO

A proteômica é uma das principais alternativas para compreender as interações do plasma seminal com os espermatozóides, a qual pode ser um modelo usual para o estudo da interação que ocorre entre o sêmen e a superfície do espermatozóide (Strzezek et al, 2005). As ferramentas para o estudo em proteômica, estão baseadas em recursos computacionais, tais como bancos de dados de seqüências, softwares de análise de imagens, sites de alinhamento de seqüências e de análises tridimensionais, obtidas por técnicas de biologia molecular. 
O plasma seminal é constituído por uma complexa mistura de proteínas e outras moléculas, no entanto, muitas ainda têm sua função desconhecida. Alguns polipeptídeos já foram caracterizados em outros animais, mas em galos há poucos estudos nesta linha. A determinação do perfil protéico do plasma seminal é fundamental para identificar as funções e propriedades destes polipeptídios no mecanismo de regulação molecular dos parâmetros fisiológicos reprodutivos, uma vez que o fluído seminal é constituído por uma complexa mistura de proteínas. No entanto, ainda muitas permanecem com função desconhecida (Strzezek et al, 2002; Jelínková et al., 2003).
A identificação dos grupos protéicos presentes no sêmen pode dar suporte a diversas linhas de pesquisas tais como: criopreservação de gametas, buscando marcadores de congelabilidade; melhoramento de técnicas de fertilização artificial, através da caracterização de proteínas específicas envolvidas na atividade espermática; e recentemente, em transgênese animal, aonde estas proteínas vêm sendo estudadas na captação de DNA exógeno através de técnicas de transferência gênica em massa, como SMGT (Sperm-Mediated Gene Transfer) (Collares, 2004).
	O método empregado com alta eficiência na separação e caracterização dos diversos polipeptídeos é a eletroforese. Muitas proteínas do plasma seminal de várias espécies têm sido analisadas através do SDS-PAGE ou por eletroforese em gel de poliacrilamida dimensional (Roncoletta et al., 1999; Kowalski et al., 2003; Lahnsteiner et al., 2004).
	O objetivo do presente estudo foi de caracterizar o perfil das proteínas do plasma seminal de galos através da eletroforese do tipo SDS-PAGE e avaliação in silico dos grupos protéicos presentes no plasma.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Neste estudo, foram utilizados 14 galos adultos saudáveis, submetidos a mesma alimentação e alojados em gaiolas individuais no Biotério Central da UFPel. A coleta de sêmen foi realizada através de massagem abdominal e centrifugado a 4000 x g durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante (plasma seminal) foi usado nas análises. O plasma seminal foi recentrifugado a 14000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Cada amostra foi preparada para a eletroforese com 10 µl de plasma seminal, 20µl de soro fisiológico e  15 µl de tampão de amostra (Glicerol; Tris-Hcl 0,6173M - pH 6,8; B-mercaptoetanol; SDS 10%; azul-de-bromofenol; H2O), após foram submetidas à fervura por 10 minutos para desnaturação protéica. A eletroforese do tipo SDS-PAGE, foi feita pelo método vertical com o sistema BIO-RAD Mini-Protean 3 Cell (Bio-rad Laboratories, USA). Foram feitas corridas com géis concentrados a 15%, primeiramente com uma voltagem de 70 V, por 20 minutos, para haver uma concentração das proteínas, e após a 120 V por 70-80 minutos. Como padrão, foi utilizado o marcador molecular BenchMark Protein Ladder (Invitrogen, Carlsbad, USA). Os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue.
 O processo de descoramento dos géis foi feito em solução descorante por 2 horas, em banho-maria, a uma temperatura de 75°C. A análise dos zimogramas foi baseada, na clara visualização e distinção das bandas protéicas formadas durante a eletroforese. Os dados obtidos pela eletroforese foram analisados pelo software TotalLab TL100 v. 2006 (Nonlinear Dynamics, UK). Com os valores dos pesos moleculares das bandas eletroforéticas obtidos na eletroforese unidimensional foi realizado um estudo in silico nos principais bancos de dados protéicos (PDB, InterPro, BioThesaurus, PIR) a fim de identificar os possíveis grupos protéicos presentes no plasma seminal de galos. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram detectadas 18 bandas protéicas no plasma seminal de galos, com peso molecular variando de 214.6 kDa a 7.7 kDa. As bandas com 52.9 ± 0.65 e  25.9 ± 0.5 kDa foram detectadas em todas as amostras analisadas. Proteínas com 115.5 ± 0.2 e 62.4 ± 0.3 kDa foram detectadas em 12.5% das amostras analisadas. Seis bandas protéicas com 214.6 ± 12.1, 101.3 ± 3.7, 57.3 ± 0.8, 45.0 ± 0.82, 35.9 ± 0.5 e 11.3 ±0.1 kDa foram detectadas em 87.5% das amostras. A banda com 57.3 ± 0.8 kDa mostrou uma alta concentração de polipeptídeos, sendo bem mais concentrada que as demais. Nenhum macho apresentou todas as 18 bandas no plasma seminal. A composição, a conformação e o tamanho destas proteínas são específicos para cada espécie, as quais são estáveis também sob condições específicas (Jelínková et al., 2003). Em mamíferos, o evento da fertilização inclui interações bioquímicas altamente reguladas, tais como: ligação de proteínas seminais na superfície dos espermatozóides durante a ejaculação, interação de proteínas de membrana dos espermatozóides com células epiteliais do oviducto, capacitação espermática, reconhecimento dos gametas, ligação entre os gametas, reação acrossômica, penetração do espermatozóide na zona pelúcida e fusão dos gametas (Jansen et al., 2001; Strzezek et al., 2005). A compreensão de mecanismos moleculares envolvidos nos processos de maturação de espermatozóides e associação com componentes do plasma seminal, tem fornecido informações para a determinação de marcadores bioquímicos associados com a qualidade do sêmen. A aplicação de marcadores bioquímicos para identificar propriedades biológicas do sêmen pode providenciar informações específicas sobre a funcionalidade espermática durante o congelamento do sêmen.

	 Figura 1. SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal de galos, mostrando a distribuição das bandas de acordo com seu peso molecular. 

4. CONCLUSÕES

	Através da caracterização em SDS-PAGE foi possível identificar proteínas conservadas a todos os ejaculados dos exemplares analisados, possibilitando que estudos relacionados a marcadores bioquímicos de qualidade do sêmen de aves sejam realizados. Isso permite uma nova abordagem do manejo reprodutivo dos animais bem como o uso dos marcadores bioquímicos no melhoramento. Ainda há a possibilidade da busca de marcadores correlacionados com a congelabilidade do sêmen ou identificação de fatores inibidores de fertilidade em sêmen de aves.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

COLLARES T., BONGALHARDO D.C., DESCHAMPS J.C., MOREIRA H.L.M. Transgenic animals: The melding of molecular biology and animal reproduction Animal  Reproduction, 2005, v.2, p.11-27.

JANSEN, S., EKHLASI-HUNDRIESER, M., TÖPFER-PETERSEN, E. Sperm adhesion molecules: structure and function. Cells Tissues Organs, 2001, v. 168 p. 82-92.

JELÍNKOVÁ, P., MANÁSKOVÁ, P., TICHÁ, M., JONÁKOVÁ, V. Proteinase inhibitors in aggregated forms of boar seminal plasma proteins. International Journal of Biological Macromolecules, 2003, v. 32, p. 99-107.

KOWALSKI, R., GLOGOWSKI, J., KUCHARCZYK, D., GORYCZKO, K., DOBOSZ, S., CIERESZCO, A. Proteolytic activity and eletrophoretic profiles pf proteases from seminal plasma of teleosts. Journal of Fish Biology, 2003, v.63, p. 1008-1019.

LAHNSTEINER, F., MANSOUR, N., BERGER, B., Seminal plasma proteins prolong the viability of rainbow trout (Oncorynchus mykiss) spermatozoa. Theriogenology, 2004, v.62, p. 801-808.

RONCOLETTA, M., FRANCESCHINI, P. H., LIMA, V. F. M. H., RODRIGUES L. H., OLIVEIRA, M. A., SILVA, C. Perfil em SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal e sua relação com a congelabilidade do sêmen de touros doadores da raça gir. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, 1999, v.36, p. 36-42.

STRZEZEK, J., SAIZ-CIDONCHA, F., WYSOCKI, P., TYSZKIEWICZ, A., JASTRZEBSKI, M. Seminal plasma proteins as markers of biological value of boar semen. Animal Science Papers and Reports, 2002, v. 20, p. 255-266.

STRZEZEK, J., WYSOCKI, P., KORDAN, W., KUKLINSKA, M., MOGIELNICKA, M., SOLIWODA, D., FRAZER, L. Proteomics of boar seminal plasma – current studies and possibility of their application in biotechnology of animal reproduction. Reproduction Biology, 2005, v. 5, p. 279-290.