AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE 2,4D SOBRE A FORMAÇÃO DE CALOS A PARTIR DE ANTERAS DE MAMONA

Borges, Clarissa de Souza1;Cuchiara, Cristina Copstein1; Silva Sergio D. dos Anjos 2; Bobrowski, Vera Lucia1,3

1 Laboratório de Genética, DZG, IB, UFPel, Campus Universitário s/n, Caixa Postal 354, CEP 96010-900
2 Pesquisador CPACT, EMBRAPA, Pelotas, RS
3 Professor Adjunto, DZG, IB, UFPel
e-mail: cborges_ib@ufpel.edu.br

1. INTRODUÇÃO

A mamoneira (Ricinus communis L.), também conhecida como carrapateira ou rícino, pertencente à família Euphorbiaceae, é originária da Índia, foi importada para o Brasil no século XVI, onde é largamente difundida, e não havendo praticamente terreno baldio, mata ou lavoura abandonada onde ela não cresça. Sendo considerada uma das principais oleaginosas do mundo, cujo óleo, é um dos mais versáteis da natureza (TÁVORA,1998).
A mamona apresenta-se como uma alternativa de grande importância econômica, devido ao seu alto teor de óleo (48% a 50%) e também por mostrar-se resistente ao clima adverso quando se verificam perdas totais em outras culturas.
A busca por variedades com excelente produtividade para obtenção de biodiesel é premente, sendo assim a variabilidade genética é essencial para qualquer programa de melhoramento que tenha por objetivo selecionar características desejáveis das plantas como maior produtividade de sementes, precocidade, maior teor de óleo, menor teor de ricina e ricinina, resistência a pragas e doenças entre outros.
Dentre as técnicas de cultivo in vitro, a cultura de anteras, apresenta-se como uma ferramenta biotecnológica, importante na obtenção de plantas duplo-haplóides e de grande utilidade em programas de melhoramento, sendo sua principal vantagem o fato de que em apenas uma geração em laboratório poderão ser obtidas plantas 100% homozigotas, permitindo dessa forma, um extraordinário ganho de tempo na fixação de caracteres de interesse e na otimizacão da seleção de constituições genéticas superiores (LENTINI et al.1994).
As plantas haplóides podem ser obtidas de duas maneiras, androgênese direta ou por androgênese indireta. Na androgênese indireta, os micrósporos, em vez de passarem pela embriogênese, eles dividem-se algumas vezes, formando calos, os quais emergem através da parede da antera. Normalmente a regeneração de plantas via calo ocorre com maior freqüência (PETERS et al. 1998).
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dos diferentes meios de cultivo na obtenção de calos, os índices de contaminação e oxidação a partir de anteras de manona.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Botões florais da cultivar IAC-80, medindo 3-4 mm foram utilizados para a retirada das anteras. O material vegetal foi retirado de uma população em cultivo no campo experimental da Embrapa Clima Temperado, altitude 60m, latitude 31°41’ Sul e longitude 52°21’ Oeste, localizada em Pelotas, RS.
Para a assepsia dos botões florais estes foram primeiramente lavados em água destilada por 5 minutos, posteriormente imersos em álcool 70% por 3 segundos e então mantidos por 10 min em solução de 20% hipoclorito de sódio comercial. A seguir, o material foi lavado três vezes em água destilada esterilizada, permanecendo nesta até a transferência para o meio de cultura. Os botões florais foram transferidos para placas de Petri contendo ácido ascórbico (50mg.L-1) para secção das anteras, afim de evitar oxidação das mesmas até sua transferência para o meio de cultivo. Todos os procedimentos de desinfestação e transferência para o meio de cultura foram realizados em câmara asséptica de fluxo laminar horizontal. Foram realizados 6 tratamentos, com 5 repetições e 10 aglomerados de anteras por repetição.
O meio mineral básico utilizado para formação de calos foi o meio MS (MURASCHIGE & SKOOG, 1962), variando os tratamentos pela adição de 2,4-D de acordo com a tabela abaixo:

TABELA 1. Meios de cultura utilizados no cultivo de anteras de mamona (Ricinus comunnis L.). Pelotas, UFPel/2006.
Meio	Composição	
M1	MS básico	
M2	MS + 0,5mg. L-1 2,4-D	
M3	MS + 1,0mg. L-1 2,4-D	
M4	MS + 1,5mg. L-1 2,4-D	
M5	MS + 2,0mg. L-1 2,4-D 	
M6	MS + 2,5mg. L-1 2,4-D	

Os meios de cultura tiveram o pH ajustado para 5,7 ± 1 utilizando NAOH 1N ou HCl 1N e autoclavados a 120°C e 1,2 atm. de pressão por 20 minutos. Logo após o meio foi transferido para placas de Petri estéreis em câmara de fluxo laminar. Após inoculação o material foi mantido em câmara de crescimento a 25 ± 1°C no escuro por 60 dias.
As avaliações do percentual de formação de calos, oxidação e contaminação foram realizadas a cada 15 dias até completar 60 dias de cultivo.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Aos 60 dias após a inoculação das anteras, verificou-se que os maiores índices de oxidação ocorreram nos meios M1 (52%), M4 (62%) e M6 (60%) (Tabelas 1 e 2) porém estes resultados foram inferiores aos relatados por Figueira et al. (2003) em trabalhos com anteras de café, utilizando o regulador de crescimento 2,4 D. 
As melhores resposta para indução de calos, foram observadas nos meios M4, M5 e M6 (Tabela 2). Podemos visualizar também que houve formação de calos em todos os meios testados (figura 1) embora o aumento da concentração do regulador de crescimento 2,4 D causou um aumento na formação de calos. Dados similares foram observados por Vargas (2006).
Os meios M4 e M6 apresentaram um maior número de anteras oxidadas, bem como maior percentual de calos formados, dados não corroboram com aqueles observados por Custódio et al. (2005), onde citam que a oxidação das anteras pode inibir totalmente a indução de calos. 
	Com relação à avaliação do percentual de contaminação de anteras o índice observado neste experimento foi nulo. As condições de cultivo da planta doadora bem como os procedimentos de assepsia podem influenciar nos índices de contaminação. Neste trabalho mesmo as coletas sendo realizadas a partir de plantas mantidas a campo, portanto sujeitas a ação de agentes externos (Custódio et al., 2005; Vargas, 2006), os procedimentos de assepsia foram eficientes. 

TABELA 2. Porcentagem de oxidação e formação de calo a partir de anteras de mamona (Ricinus comunnis L.). Pelotas, UFPel/2006.

Meio	15 dias	30 dias	45 dias	60 dias	
	% oxidação	%calo	%oxidação	%calo	%oxidação	%calo	%oxidação	%calo	
M1	34	0	48	0	56	4	56*	20	
M2	24	4	26	8	28	14	32	26	
M3	30	4	34	8	36	20	32	32	
M4	24	12	50	20	54	46	62*	60**	
M5	14	18	40	26	42	38	46	52**	
M6	48	16	56	20	60	40	60*	64**	
* Meios com maior percentual de oxidação observados
** Meios com maior percentual de indução de calos observados

B

A

B

A

Figura 1. Formação de calo a partir de antera de mamona. A. Inicio de oxidação em calo a partir de antera. B. Formação de calo a partir de antera.

4. CONCLUSÃO
Basedo nos resultados obtidos nesse estudo pode-se verificar a eficiência do 2,4D na indução de calos, sendo que 2,0mg L-1  deste regulador induziu menor oxidação e maior formação de calos  a partir de anteras de mamona.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CUSTÓDIO, L., CARNEIRO, M. F., ROMANO, A., Microsporogenesis and anther culture in carob tree (Ceratonia siliqua L.) Scientia Horticulturae, n°104, p. 65-77, 2005. 
FERREIRA, E. R. et al. Efeito de pé-tratamento em botões florais e influência do 2,4 D no cultivi in vitro de anteras de cafeeiro (Coffea arabia L.). Biosel J. Uberlândia, v.19, n.2,p. 49-55, 2003.
LENTINI, Z. et al. Mejoramiento del arroz com cultivo de anteras: aplicaciotes de el desarrollo de germoplasma adaptado a ecossistemas latinoamericanos Y el Caribe. Cali: CIAT, 1994. 79 p.
PETERS, J. A.; BOBROWSKI, V. L.; ROSINHA, G. M. S. Produção de haplóides e duplo haplóides. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSCO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. [S.l.: s.n.], 1998. v. 2, p. 569-612.
TÁVORA, F. J. A. F. A cultura da mamona (Ricinus communis). Fortaleza: EPACE, 1982, 111p.
VARGAS, D.P. Mamona (Ricinus communis l.): cultura de antera, viabilidade e conservação de pólen. 2006, 78f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal) -  IB – Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.