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XANTANA SINTETIZADA POR CEPAS Xanthomonas campestris pv pruni EM DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO

BOROWSKI, Joyce Moura^1; REDIES, Clarice Roll^1; MICHELS, Rudah ^1; BORGES, Caroline Dellinghausen^1; VENDRUSCOLO, Claire Tondo^1.

1Laboratório de Biopolímeros/Centro de Biotecnologia/Universidade Federal de Pelotas – Campus Universitário s/n - Caixa Postal 354 - CEP 96010-900. joyceborowski@ibest.com.br

1. INTRODUÇÃO

A goma xantana é um polissacarídeo produzido por bactérias do gênero Xanthomonas sendo amplamente utilizada em diversos segmentos industriais como espessante e estabilizante (Jeanes, 1974). 
Grande parte da literatura referente à produção de xantana está baseada em cepas obtidas de coleções de cultura, principalmente Xanthomonas campestris NRRL B-1459 e seus derivados (Sánchez et al., 1997). Porém, o isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais, tais como solo, água, plantas, é uma atividade de grande importância para a obtenção de novas linhagens de interesse industrial. O microrganismo selecionado para um processo industrial não deve exigir meio de cultura extremamente oneroso, por questões claramente de economia do processo produtivo. Para isto, torna-se necessário o estudo de meios e cepas em escala laboratorial, a fim de obter-se a melhor relação produção x qualidade x custo. As necessidades nutricionais de Xanthomonas campestris para a produção de xantana são bastante flexíveis, o que permite a utilização de diferentes substratos na fermentação (Schmidell, 2001).
Segundo Born et al. (2002) a produção mundial de xantana no ano de 2001 foi estimada em 35.000 toneladas. A demanda na produção desta goma tem aumentado a cada ano e a estimativa é de um crescimento anual de 5-10%. 
Este trabalho objetivou avaliar a produção e o comportamento reológico das xantanas sintetizadas por diferentes cepas de Xanthomonas campestris pv pruni em diferentes meios de produção. 

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Microrganismo
A bactéria utilizada foi Xanthomonas campestris pv pruni cepas 104, 106 e 115, provenientes da bacterioteca do CPACT-EMBRAPA. 

2.2 Produção de xantana
A fermentação submersa foi realizada em meio líquido nas seguintes condições: 28°C por 24 horas na fase inicial. Após, para as 72h seguintes o produto da primeira fase foi adicionado nos seguintes meios: MPII (em g.L^-1: NH_4H_2PO_4 1,5; K_2HPO_4 2,5; MgSO_4.7H_2O 0,2; sacarose 50,0) (Cadmus et al., 1978 modificado), MPIIb (em g.L^-1: NH_4H_2PO_4 1,5; K_2HPO_4 2,5; MgSO_4.7H_2O 0,2; ácido cítrico 2,0; sacarose 50,0) (Cadmus et al., 1978 com modificações), MPI (em g.L^-1: NH_4H_2PO_4 1,5; K_2HPO_4 2,5; MgSO_4.7H_2O 0,2; ácido cítrico 2,0; KH_2PO_4 5,0; H_3BO_3 0,006; (NH_4)_2SO_4 2,0; FeCl_3 0,0024; CaCl_2.2H_2O 0,002; ZnSO_4 0,002; sacarose 50,0) (Cadmus et al., 1978; Souw & Demain, 1979), MPIIc (em g.L^-1: NH_4H_2PO_4 1,5; K_2HPO_4 2,5; MgSO_4.7H_2O 0,2; sacarose 50,0) (Cadmus et al., 1978 modificado em 2004 (1) por Vendruscolo), MPIb (em g.L^-1: NH_4H_2PO_4 1,5; K_2HPO_4 2,5; MgSO_4.7H_2O 0,2; ácido cítrico 2,0; KH_2PO_4 5,0; H_3BO_3 0,006; (NH_4)_2SO_4 2,0; FeCl_3 0,0024; CaCl_2.2H_2O 0,002; ZnSO_4 0,002; sacarose 50,0) (Cadmus et al., 1978 modificado em 2004 (2) por Vendruscolo); Souw & Demain, 1979), Meio A (em g.L^-1:MgSO_4.7H_2O 0,24; (NH_4)_2SO_4 3,33; H_3BO_3 0,0072; FeCl_3 0,0042; KH_2PO_4 7,2; CaCO_3 0,029; ácido cítrico 2,0; ZnO 0,006; extrato de levedura 0,75; peptona 0,34; glucose 30,0) (Esgalhado, Roseiro & Collaço, 1995) e Meio B (NH_4H_2PO_4 1,5; K_2HPO_4 2,5;  MgSO_4.7H_2O 0,6; ácido cítrico 2,0; K_2HPO_4  0,5; H_3BO_3 0,006; (NH_4)_2SO_4 2,0; FeCl_3 0,0024; CaCl_2 0,0019; ZnSO_4 0,0019;  extrato de levedura 0,75; peptona 0,34; sacarose 50,0). Os meios foram ajustados para pH 7,0 e esterilizados a 121°C por 15 minutos, separadamente da sacarose. A produção do biopolímero foi realizada em erlenmeyers de 250mL conforme Antunes 2003. O caldo fermentado foi centrifugado (Sorvall Instruments modelo RC-5C) a 10.000 rpm, 4°C por 30 minutos. A xantana foi recuperada pela adição de etanol 96ºGL na proporção de quatro partes de álcool para uma do caldo fermentado. O polímero recuperado foi seco em estufa a 56ºC, triturado e armazenado em recipientes de vidro. A produção de xantana e a análise de viscosidade foram realizadas em triplicata.

2.3 Viscosidade
O comportamento reológico das soluções aquosas da xantana a 1% (m/v) foi mensurado em reômetro (Haake RS150) utilizando um sistema de cilindros concêntricos e sensor DG 41 a 25ºC. A taxa de deformação foi na faixa de 0.01 a 100s^-1 por 300s (Xuewu et al. 1996, modificado por Diaz, 2002).

2.4 Estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada através da análise de variância e a comparação das médias pelo teste de Tukey com nível de significância 5%. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O meio MPII foi utilizado como padrão neste estudo, pois apresentou melhor relação entre produção e viscosidade de xantana produzida por X. campestris pv pruni em trabalhos anteriores. O meio MPIIb que difere do MPII pela adição de ácido cítrico, apresentou maior produção de xantana quando comparado com o meio padrão para as cepas 106 e 115, entretanto não diferiu significativamente para a cepa 104 (Figura 1).   
Para as cepas 104 106 e 115 os resultados de produção de xantana no meio MPI foram superiores e estatisticamente diferentes ao MPII. Antunes et al. (2002) avaliou treze cepas do patovar pruni de X. campestris quanto à produção em meios MPI e MPII, tendo verificado, também, maior produção no meio MPI para todas as cepas, variando de 13,1 a 26,4 g.L^-1. Neste trabalho a produção com os meios MPI e MPII variou entre 8 e 10 g.L^-1. Os meios MPIb e MPIIc apresentaram uma queda na produção do biopolímero em relação aos meios A e B, nos quais a produção variou entre 9 e 11 g.L^-1 para o meio B e entre 11 e 15 g.L^-1 para o meio A. No meio A em que a fonte de carbono é glicose, os resultados de produção alcançados foram superiores e estatisticamente diferentes aos demais meios para as cepas 106 e 115. No entanto, quando se compara os resultados do meio B com o meio A, em que a diferença é apenas na fonte principal de carbono, que no meio B é a sacarose, os valores de produção foram inferiores aos do meio A. Leela & Sharma (1999) estudaram a influencia da fonte de carbono na produção de xantana por X. campestris, e também constataram maior produção da goma em meios que utilizam a glucose.                                       

Figura 1. Produção de xantana (g.L^-1) por cepas de X. campestris pv pruni em diferentes meios de cultivo.

Figura 2. Viscosidade (mPa.s) a 25ºC na taxa de deformação 10s^-1 da xantana sintetizada por cepas de X. campestris pv pruni em diferentes meios de cultivo.

Todas as soluções aquosas de xantana 1% (m/v) apresentaram comportamento pseudoplástico, ou seja, a viscosidade diminuiu à medida que a taxa de deformação aumentou. A viscosidade das soluções aquosas das amostras de xantana foi influenciada pela composição do meio de produção e pela cepa utilizada. Os resultados de viscosidade variaram de 24,5 a 453 mPa.s na taxa de deformação 10s^-1 a 25°C (Figura 2).
A viscosidade das soluções de xantana sintetizadas no meio padrão e seus derivados (MPII, MPIIb e MPIIc) apresentaram valores superiores e significativamente diferentes aos demais meios.  Para as cepas 106 e 115, a maior viscosidade das soluções de xantana foi obtida com o meio MPII, no entanto, para a cepa 104 a maior viscosidade foi obtida com meio MPIIc, em comparação com o meio MPII. 
A adição de ácido cítrico ao meio padrão (MPIIb) contribuíu para o aumento da produção de xantana, no entanto promoveu um decréscimo na viscosidade do polímero para todas as cepas, quando comparado com o meio padrão.
A viscosidade das soluções aquoasas das xantanas obtidas pela utilização do meio MPI foi inferior ao meio padrão MPII. A utilização do meio MPIIb reduziu a viscosidade dos polímeros sintetizados por todas as cepas, em relação ao meio MPII porém aumentou também para todas as cepas quando o meio utilizado foi o MPIIc. No entanto, a utilização dos meios A, B, MPI e MPIb produziram polímeros com baixa viscosidade para as cepas 104, 106 e 115.

4. CONCLUSÃO

A produção de xantana e o comportamento reológico foram influenciados, pela cepa e pelo meio de cultivo. A produção de xantana não apresentou relação com a viscosidade, sendo variável entre as cepas. O melhor equilíbrio entre produção e viscosidade para todas as cepas foi alcançado no meio MPII. 

5. REFERÊNCIAS

ANTUNES, A. E. C.; MOREIRA, A. S.; VENDRUSCOLO, J. L. S.; VENDRUSCOLO, C. T. Screening of Xanthomonas campestris pv pruni Strains According to Their Production of Xanthan and its Viscosity and Chemical Composition. Brasilian Journal, v.6, n.2, p.317-322, jul.-dez., 2003.
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DIAZ, Patricia S. Influência de parâmetros físicos e químicos e da adição de íons no comportamento reológico de gomas xantana. Brasil, 2002. 65f Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Agroindustrial)–Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
ESGALHADO, M. E.; ROSEIRO, J. C.; COLLAÇO, M. T. A. Interactive effects of pH and temperature on cell growth and polymer production by Xanthomonas campestris. Process Biochemistry, v. 30, n. 7, p. 667-671, 1995.
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TEIXEIRA, Andréa Miranda. Tempo de Fermentação na Produção e Qualidade de Xantana e no Perfil Eletroforético de X. campestris pv pruni, Brasil. 2005. 70f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Agroindustrial)-Faculdade de Agronomia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
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