Title: Capacidade fertilizante de sêmen criopreservado das de camundongos (Mus musculus) das linhagens SWISS- e BALB/c
Author: PIGPEL
Last saved by: usuario
Company: CENBIOT

CAPACIDADE FERTILIZANTE DE SÊMEN CRIOPRESERVADO DE CAMUNDONGOS (Mus musculus) DAS LINHAGENS SWISS-ALBINA E BALB/C
PIASSI, Lígia Maria; CORCINI, Carine Dahl; LEON, Priscila Marques Moura de*; MARTINS, Naiana de Oliveira; PANZARDI, Andrea; SCHIAVON, Raquel Schiavon; DESCHAMPS, João Carlos.
Centro de Biotecnologia Agrícola - Laboratório de Reprodução Animal - FAEM/UFPel Campus Universitário  – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. *primleon@hotmail.com

1.	INTRODUÇÃO

A utilização de animais como modelos experimentais em pesquisa científica, tem sido de extrema importância na área médica. Sendo o camundongo um instrumento de laboratório, por apresentar um pequeno porte, ser de manutenção relativamente barata em biotérios, e por possibilitar a avaliação do objeto de pesquisa, por diversas gerações, em um pequeno período de tempo [7].  
O camundongo é membro da ordem Rodentia, família Muridae, gênero Mus, subgênero Mus, espécie mus domesticus domesticus, apresentando um grande número de mutantes com centenas de colônias geneticamente definidas. Estas colônias são obtidas através de sistemas de acasalamentos, principalmente por endocruzamentos, entre indivíduos com ancestrais comuns, e por heterocruzamentos, evitando-se a consangüinidade.
Com a formação dos bancos de germoplasma, é possível armazenar diversos genomas na forma haplóide e, posteriormente, difundi-lo a partir da técnica de fertilização in vitro, atendendo a diversidade de animais exigida por um custo bem inferior [13].
Trabalhos realizados visando avaliar a viabilidade do congelamento de sêmen em linhagens isogenéticas, heterogenéticas e transgênicas, têm demonstrado que, cada linhagem responde diferentemente ao processo de congelamento e descongelamento. Apresentando resultados bastante variados, de motilidade espermática e fertilidade [3; 5; 8; 9; 11].
O objetivo deste trabalho foi avaliar a fertilidade in vitro, através da taxa de clivagem embrionária, do sêmen congelado de camundongos das linhagens SWISS-ALBINA (heterogenética) e BALB/c (isogenética), assim como do cruzamento entre estas linhagens.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Os animais das duas linhagens de camundongos utilizadas, SWISS-ALBINA/UFPel e BALB/c-UNICAMP, foram fornecidas pelo Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas, e mantidos sob condições controladas. Os machos apresentavam idade entre 8 e 20 semanas, e as fêmeas entre 5 a 7 semanas.
A partir do protocolo de congelamento rápido de sêmen descrito por Sztein et al. [4; 5], foram utilizados como doadores 30 machos da linhagem heterogenética SWISS-ALBINA e 15 machos da linhagem isogenética BALB/c.
Foram utilizadas 20 fêmeas SWISS-ALBINA para avaliação das amostras de sêmen criopreservadas da linhagem SWISS-ALBINA. E 10 fêmeas da linhagem SWISS-ALBINA e 15 fêmeas da linhagem BALB/c, com a finalidade de avaliar a capacidade fertilizante do sêmen de BALB/c e a interação dos cruzamentos entre as duas linhagens.
Para o descongelamento, as palhetas de sêmen foram mantidas por 5 seg em temperatura ambiente (20 °C), e mergulhadas em banho-maria a 37 °C, por 2 min. Cada dose de sêmen foi ressuspendida em 50 µl de meio Preimplantation Stage One (P-1, Irvine Scientific) suplementado com 5mg/ml de Albumina Sérica Bovina (BSA^® – Fração V, Sigma-Aldrich).
A dose inseminante calculada foi de 2 x 10^6 espermatozóides/ml. Os espermatozóides foram transferidos para gotas de 200 µl do meio P-1, recobertas com óleo mineral, permanecendo em estufa por 1h e 30 min para a capacitação do sêmen.
As fêmeas foram submetidas à superovulação, com 10 UI de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) (Novormon^®; Sintex S.A.; Argentina), e 48 a 52 h após 10 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Choriomon^®; Meizler; Suiça). De 14 a 15 h após a aplicação do hCG os oócitos foram recuperados sob lupa estereomicroscópica. Logo a seguir, os oócitos foram transferidos para placa com Fluido Tubárico Humano modificado (m-HTF, Irvine Scientific^®), sendo avaliados quanto a sua integridade morfológica.
Após o período de capacitação dos espermatozóides, os oócitos foram transferidos para as placas de fertilização. Os gametas co-incubados permaneceram em estufa por um período entre 6 e 7 horas [1]. Após, os prováveis zigotos foram lavados em 3 gotas de meio m-HTF, para retirada do maior número de espermatozóides possível, e transferidos para uma gota de meio P-1. E por fim, foram transferidos para placas contendo gotas de 60µl de meio P-1 suplementado com 10mg/ml de BSA [2] e recobertas com óleo de silicone, numa concentração de 10 zigotos por gota. Permanecendo em estufa (37°C, 5% de CO_2), para completar seu desenvolvimento. Após 24 e 36 h do final da FIV, as avaliações foram feitas em lupa estereomicroscópica, para verificação do número de embriões com duas células.
A capacidade fertilizante do sêmen criopreservado foi verificada a partir da taxa de clivagem embrionária (TXCL), obtida após a fertilização embrionária in vitro (FIV) nas duas linhagens e nos cruzamentos entre elas.
Os dados foram analisados utilizando o programa Statistix^®. A TXCL foi considerada como variável dependente, sendo comparada a partir do teste não paramétrico, qui-quadrado (x^2); e a interação entre as TXCL nos cruzamentos entre as duas linhagens, foram avaliadas a partir do teste paramétrico LSD.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em relação à fertilidade in vitro, do sêmen criopreservado de camundongos da linhagem SWISS-ALBINA, avaliada através das taxas de clivagem in vitro (TXCL) obtidas após a FIV, de um total de 289 oócitos linhagem SWISS-ALBINA inseminados, 123 (42,6%) foram fertilizados. E no cruzamento híbrido de sêmen de machos SWISS-ALBINA com um total de 107 oócitos de BALB/c, 43 (40,2%) foram clivados.
No cruzamento isogenético da linhagem BALB/c, de um total de 224 oócitos, 92 (41,1%) foram fertilizados. E no cruzamento híbrido em que os espermatozóides eram originados de machos BALB/c, de um total de 156 oócitos, 61 (39,1%) foram clivados.
Entre os cruzamentos avaliados, endocruzamentos e heterocruzamentos, não foram verificadas diferenças (P>0,05) nas TXCL (Tabela1).
Tabela 1 - Número de oócitos e taxa de clivagem embrionária obtida nos diferentes cruzamentos.
Cruzamentos | Oócitos | Clivagem (%)
♂Swiss X ♀ Swiss | 289 | 123 (42,6)
♂Swiss X ♀Balb/c | 107 | 43 (40,2)
♂Balb/c X ♀Balb/c | 224 | 92 (41,1)
♂Balb/c X ♀Swiss | 156 | 61 (39,1)
TOTAL | 776 | 319 (41,1)
	
	Como nas demais espécies, também com os camundongos, ocorre uma queda de viabilidade espermática, evidenciada pela variável MOT, pós-descongelamento [11]. Verificou-se que as porcentagens de células com motilidade progressiva variaram entre 30% e 67%, de acordo com o tratamento e o momento de avaliação, na linhagem SWISS-ALBINA, e entre 42% e 65% na linhagem BALB/c, confirmando uma queda de viabilidade pós-descongelamento e uma interação entre a viabilidade pós-descongelamento e a linhagem utilizada.
Como a função do sêmen criopreservado é ser utilizando num programa de fertilização, seja ele através de inseminação artificial ou FIV, o melhor indicador de viabilidade espermática é a capacidade fertilizante do sêmen [3; 10].
Neste trabalho, não foi constado o efeito da interação entre os tratamentos utilizados na criopreservação do sêmen e o cruzamento entre as linhagens de camundongos, avaliada a partir do endocruzamento da linhagem heterogênica SWISS-ALBINA e da isogênica BALB/c, e dos heterocruzamentos, entre as duas linhagens, SWISS-ALBINA versus BALB/c. Resultados próximos foram observados por Glenister et al., os quais obtiveram taxas de clivagem embrionária variando de 37% a 57% em linhagens híbridas [12]. Entretanto, porcentagens de clivagem variáveis entre 0% e 40% foram observadas usando oócitos híbridos [5] e 80% em linhagens como a CB6F1 [6].

4. CONCLUSÃO

	Os resultados obtidos demonstram a viabilidade espermática pós-congelamento, o que possibilita a utilização do sêmen congelado à técnica de FIV, viabilizando a formação de banco de gametas masculinos das linhagens SWISS-ALBINA e  BALB/c.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] A. Revel, N. Moshe, A. Helman, A. Safran, A.  Simon, M. Koler, Mouse embryos generated from frozen-thawed oocytes can successfully survive a second cryopreservation, Hum. Reprod., 19 (2004) 666-669.

[2] B. Hogan, F. Constantini, E. Lacy, Manipulating the mouse embryo:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1986, pp. 331.

[3] H. Nishizono, M. Shioda, T. Takeo, I. Tetsumi, N. Nakagata, Decrease of fertilizing ability of mouse spermatozoa after freezing and thawing is related to cellular injury, Biol. Reprod., 71 (2004) 973-978.

[4] J.M. Sztein, J.S. Farley, A.F. Young, L.E. Mobraaten, Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing, Cryobiology, 35 (1997) 46-52.

[5] J.M. Sztein, J.S. Farley, L.E. Mobraaten, In Vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm, Biol. Reprod., 63 (2000) 1774-1780. 

[6] J.M. Sztein, J.S. Noble, J.S. Farley, L.E Mobraaten, Comparison of permeating and nonpermeating cryoprotectants for mouse sperm cryopreservation, Cryobiology, 41 (2001) 8 – 39.
	
[11] K. Mochida, M. Ohkawa, K. Inoue, D.M. Valdez JR, M. Kasai, A. Ogura, Birth of mice after in vitro fertilization using C57BL/6 sperm transported within epididymides at refrigerated temperatures, Theriogenology, 64 (2004) 135-43.

[7] M.M. Braggio, A.R.S. Martins, V.B. Valero, Influência do manejo na produtividade e no desenvolvimento de camundongos (Mus musculus), Arq. Inst. Biol. São Paulo, 70 (2003) 149-153

[8] N. Nakagata, Cryopreservation of mouse spermatozoa, Mamm. Genome, 11 (2000) 572-576.

[9] N. Nakata, Use of Cryopreservation techniques of embryos and spermatozoa for production of transgenic (Tg) mice and for maintenance of Tg mouse lines, Lab. Anim. Sci., 46 (1996) 236-238.

[10] N. Songsasen, S.P. Leibo, Cryopreservation of mouse spermatozoa: I. Effect of seeding on fertilizing ability of cryopreserved spermatozoa, Cryobiology, 35 (1997) 240-254.

[11] N. Songsasen, S.P. Leibo, Cryopreservation of mouse spermatozoa: II. Relationship between survival after cryopreservation and osmotic tolerance of spermatozoa from three strains of mice, Cryobiology, 35 (1997) 255-269.

[12] P.H. Glenister, C.E. Thornton, Cryoconservation – archiving for the future. Mamm. Genome, 11 (2000) 565-571.

[13] T.Z. An, M. Iwakiri, K. Edashige, T. Sakurai, M. Kasai, Factors affecting the survival of frozen-thawed mouse spermatozoa, Cryobiology, 40 (2000) 237-249.