MUTAÇÃO SÍTIO-DIRIGIDA DE GENES DE Mycoplasma hyopneumoniae PARA CLONAGEM E EXPRESSÃO EM Escherichia coli

HARTWIG, Daiane1; GALLI, Vanessa1; SIMIONATTO, Simone1; LUERCE, Tessália Diniz1; POHL, Paula Cristiane2; DELLAGOSTIN, Odir Antônio1

1Laboratório de Biologia Molecular – CenBiot  – IB/UFPel
2Laboratório de Imunologia Aplicada à Sanidade Animal – Cbiot - UFRGS
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. daiane_dh@yahoo.com.br

1. INTRODUÇÃO

 Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), considerada a doença respiratória de maior relevância em suínos. Ela tem ampla abrangência, acometendo cerca de 80% das criações de suínos em todo o mundo, acarretando grandes perdas econômicas para o setor (Sobestiansky et al., 1999). Para o controle da infecção são utilizados antibióticos, técnicas de manejo animal, além da prevenção através da vacinação (Fano et al., 2005) 
As vacinas mais utilizadas no controle da PES são bacterinas, que contém células totais do agente mortas. A prática de produção destas bacterinas é dispendiosa, pois M. hyopneumoniae ainda que cultivável in vitro, possui crescimento lento e pobre, exigindo meio enriquecido, o que encarece excessivamente a produção deste tipo de vacina (Chen et al., 2001). Neste contexto, a busca de novas estratégias para desenvolvimento de uma vacina eficaz se torna necessária. O repertório de antígenos até então caracterizados e disponíveis para utilização em formulações vacinais é pequeno (Chen et al., 2001). Assim, novos estudos devem dar ênfase, principalmente, à avaliação de antígenos com potencial imunoprotetor.
Com o resultado do seqüenciamento da cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae e da cepa J (não-patogênica,) realizado pela Rede Sul de Análise de Genomas e Biologia Estrutural (PIGs), foram identificadas 662 regiões codificadoras (CDS) de proteínas (Vasconcellos, 2005). A análise in silico destas regiões revelou 136 CDSs de proteínas transmembrana e 41 de proteínas secretadas sendo estas que possuem maior potencial imunogênico.
Uma dificuldade na produção de proteínas recombinantes de M. hyopneumoniae em laboratórios de Biologia Molecular é a produção destas proteínas em um sistema de expressão heterólogo, como por exemplo, em Escherichia coli, uma vez que o código genético de M. hyopneumoniae possui o códon TGA, que codifica para o aminoácido triptofano (Dybvig & Voelker, 1996), enquanto que em E. coli TGA é um codon de terminação. Portanto, a substituição na seqüência do DNA do códon TGA para TGG, o qual codifica para o aminoácido triptofano em E. coli, resolveria este problema.
Desta forma, o objetivo do presente estudo foi utilizar a técnica de mutação sítio-dirigida para substituição do códon TGA por TGG, nos alvos de M. hyopneumoniae selecionados, possibilitando a clonagem e expressão destes em E. coli, utilizando-se o vetor de clonagem direcional pET200D-TOPO.
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Seleção dos alvos
Tendo como base as CDSs identificadas pelo seqüenciamento da cepa 7448, as 136 CDSs de proteínas transmembrana e as 41 CDSs de proteínas secretadas foram analisadas com o programa Vector NTI 8.0 (Informax) e selecionadas conforme os seguintes critérios: tamanho em pares de bases (pb) da seqüência sem TGAs e hidrofobicidade da proteína. Optou-se por fazer a mutação sítio-dirigida em seqüências que apresentassem apenas um códon TGA, com isso aumentando o tamanho da proteína em mais de 100 aa, ou seja, 300 pb. 
2.2 Desenho dos primers 
Primers específicos para a amplificação dos genes alvos foram desenhados com o auxílio do programa Vector NTI 8.0 (Informax), para realizar a amplificação dos genes em dois segmentos, sendo estes sobrepostos cerca de 12 nucleotídeos. O primeiro segmento foi amplificado com um primer forward, que não possui mutação e um reverso com mutação (região A) e o segundo segmento com um primer forward com mutação e um reverso sem mutação (região B). Os primers com mutação foram desenhados para anelar internamente na seqüência do gene alvo, apresentando uma seqüência alterada, onde o TGA foi substituído por um TGG. O primer externo forward (sem mutação) apresenta na sua extremidade 5’ uma seqüência de 4 nucleotídeos (CACC), necessária para clonagem direcional no vetor pET200D-TOPO (Invitrogen). 
2.3 Amplificação dos segmentos e mutação sítio-dirigida
As amplificações foram realizadas com o auxílio da técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), utilizando a enzima Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen). Na primeira PCR foram amplificadas as regiões A e B, separadamente, utilizando como template DNA genômico de M. hyopneumoniae 7448 e os respectivos primers para cada região. Os produtos desta amplificação foram purificados, quantificados e submetidos a uma segunda PCR, sem a presença de primers e tendo como DNA molde o produto resultante da amplificação na primeira PCR (regiões A e B), para extensão de todo o gene. Utilizou-se o produto desta PCR para realização da última PCR (terceira), onde foram utilizados os primers externos (sem mutação) para amplificação do gene inteiro, já com a mutação do sítio TGA. As reações de amplificação foram feitas em um gradiente de temperatura para anelamento dos primers, as seguintes temperaturas foram usadas: 45°C, 50°C, 55°C e 60°C.
2.4 Clonagem dos produtos e transformação em E. coli
Na clonagem utilizou-se 3 ng para genes de até 1 kb e 5 ng para até 2 kb. A reação de clonagem foi realizada segundo especificações do fabricante do kit Champion® pET200D-TOPO pET200D-TOPO (Invitrogen). Os vetores foram inseridos por eletroporação em células competentes de E. coli Top10F. As cuturas transformadas foram plaqueadas em meio Luria Bertani (LB), suplementado com canamicina 100 µg/mL e incubadas a 37° C por aproximadamente18 horas.
2.5 Triagem dos clones recombinantes
Após o período de incubação as colônias transformadas foram inoculadas em  placas de cultivo de 96 cavidades, contendo meio 2YT líquido, acrescido de canamicina 100 µg/mL. As placas foram incubadas sob agitação (225 rpm) à 37° por 18 horas e os clones submetidos à um protocolo de triagem de recombinantes (Jouglard et. al., 2002). Para a confirmação dos clones recombinantes fez-se digestão com as enzimas de restrição XbaI e HindIII, para a liberação do inserto. 

3.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após a análise das 177 CDSs (41 secretadas e 136 transmembranas) de M.hyopneumoniae, realizada com o programa Vector NTI 8.0 (Informax), optou-se por fazer mutação-sítio dirigida em 10 alvos, 5 que codificam proteínas secretadas e 5 transmembrana. O esquema da abordagem utilizada para inserir a mutação, exemplificando suas regiões A e B, pode ser visualizado na figura 1.

Figura 1: Esquema representativo de um dos genes alvos, gerado pelo programa Vector NTI 8.0. Ilustração dos segmentos a serem amplificados (regiões A e B), bem como o local de anelamento dos primers. 

Foi possível amplificar todas as regiões de interesse através da técnica PCR (Figura 2), bem com fazer as mutações sítio-dirigidas em todos os 10 alvos. Até o  momento, quatro destes foram clonados com sucesso em E.coli, através do vetor pET200D-TOPO.

Figura 2: Amplificação ilustrativa de um dos genes alvos de mutação sítio-dirigica. A – Produto da amplificação da primeira PCR (Gi675, 1047 pb). B – Segunda PCR. C – Terceira PCR. Coluna M, Marcador de Massa Molecular 1 kb DNA Ladder; colunas 1, 2, 3 e 4; região A Gi675 temperaturas de anelamento dos primers de 45°C, 50°C, 55°C e 60°C, respectivamente; colunas 5, 6, 7 e 8, região B Gi675 45°C, 50°C, 55°C e 60°C; colunas 9, 14 e 19 região AB Gi675 (1047 pb); colunas 10, 11, 12 e 13, regiões A, B e AB Gi675 a 45°C, 50°C, 55°C e 60°C e colunas 15, 16, 17 e 18, Gi675 região AB a 45°C, 50°C, 55°C e 60°C. 

Os clones foram pré-selecionados através de uma trigem inicial com fenol-clorofórmio e confirmados por digestão com as enzimas de restrição XbaI e HindIII, para verificar a presença do inserto, bem como, a orientação do mesmo (Figura 3B). Para a confirmação dos recombinantes através da digestão, levou-se em consideração a distância, no vetor, do sítio XbaI até o CACC, 146 pb e do CACC até o sítio HindII, 314 pb (Figura 3A), além disso, a presença de sítios para estas enzimas no inserto. Clones que não liberaram o padrão de bandas esperado ou que liberaram somente uma banda de 460 pb, além da referente ao restante do vetor, de mais de 5000 pb, que aparece em todos os clones, foram considerados não recombinantes.   

Figura 3 : Confirmação dos clones recombinantes, exemplificada por um dos alvos testados (Gi363, 1200 pb). A – Esquema gerado pelo programa Vector NTI 8.0 (Informax) de um dos vetores construídos. B – Gel e agarose com o produto da digestão para confirmação dos possíveis clones recombinantes, com as enzimas de restrição HindIII e XbaI. Coluna M, Marcador de Massa Molecular 1 kb DNA Ladder; colunas 14 a 17, clones do gene Gi363 liberando inserto de 1346 pb, resultante da soma 1200 pb + 146 pb, confirmando que são recombinantes. 

4.0. CONCLUSÕES

A metodologia empregada para mutação sítio-dirigida do códon TGA por TGG, nos genes alvos de M. hyopneumoniae 7448, se mostrou eficaz para 4 de 6 alvos testados até o momento, possibilitando sua clonagem em um sistema de expressão heteróloga baseado em E. coli, utilizando o vetor pET2000D-TOPO. As proteínas expressas poderão ser purificadas e avaliadas quanto a seu potencial antigênico e imunogênico, através da avaliação da resposta imune em camundongos, teste de inibição de crescimento in vitro, reatividade com soro de suínos com PES e testes de desafio.

5.0 REFERÊNCIAS

CHEN J.R.; LIAO, C.W.; MAOC.N.W.; WENG C.N.; A recombinante chimera composed of repeat region RR1 of Mycoplasma hyopneumoniae adhesin with Pseudomonas exotoxin: in vivo evaluation of specific IgG response in mice and pigs. 2001. Vet. Microbiol. v.80, p.347-357.
DYBVIG, K.; VOELKER, L.L. Molecular biology of Mycoplasmas. Annual Review of Microbiology 1996. v. 50, p. 25-27. 
FANO, E.; PIJOAN, C.; DEE, S. 2005. Dynamics and persistence of Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs. Can J Res. v.69, n.3, p.223-228.
Jouglard, S. D.; Medeiros, M. A.; Vaz, E. K.; Bastos, R. G.; Cunha, C. W.; Armoa, G. R. G.; Dellagostin, O. A. An Ultra-Rapid and Inexpensive Plasmid Preparation Method for Screening Recombinant Colonies. Abstracts American Society for Microbiology. H 71, 234,  2002.
SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D.; MORES, N.; CARVALHO, L.F.; OLIVEIRA, S.; MORENO, A.M.; ROHE, P.M.. Patologia e Clínica Suína. Art. 3 Impressos especiais, Goiânia, 1999.
VASCONCELOS, A.T.R.; FERREIRA, H.B.; BIZARRO, C.V.; et al. Swine and poultry pathogens: the complete genome sequences of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae. Journal of Bacteriology, 2005, 187, p. 5568-5577.