TRANSFORMAÇÃO DE Nicotiana tabacum L. VIA Agrobacterium tumefasciens, VISANDO A PRODUÇÃO DE VACINA RECOMBINANTE CONTRA A PNEUMONIA MICOPLÁSMICA SUÍNA

OSORIO, Marina Borges1, ROCHA, Andréa da Silva Ramos2, CONCEIÇÃO, Fabricio Rochedo3, DELLAGOSTIN, Odir Antônio4, PETERS, José Antônio5
1. Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pelotas.
 E-mail: miao@brturbo.com.br
2. Acadêmica do Curso de doutorado em Biotecnologia Agrícola, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas. 
3. Pesquisador ProDoc do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Pelotas. 
4. Professor Adjunto do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Laboratório de Biologia Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas. 
5. Professor Adjunto do Departamento de Botânica, Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas, Universidade Federal de Pelotas. 

1. INTRODUÇÃO

A produção de vacinas recombinantes utilizando plantas como biorreatores, comparada aos métodos tradicionais, pode ser uma alternativa viável. Esta estratégia vem ganhando crescente destaque na comunidade científica (Roberts, 2006). A transformação genética de plantas via Agrobacterium tumefasciens é uma estratégia eficiente na inserção de DNA exógeno em vegetais. A bactéria transfere naturalmente parte de seu genoma às células vegetais, no momento da infecção, e seu DNA pode ser manipulado por engenharia genética, de maneira a portar genes de interesse. Desse modo, no processo de infecção de células vegetais, a agrobactéria se encarregará de integrar esses genes de interesse no genoma vegetal. Plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.) são largamente utilizadas por serem facilmente transformadas, terem ciclo curto e produzirem grande quantidade de sementes (Brasileiro et al., 1998). A partir da totipotência das células vegetais é que se torna possível a utilização da planta como biorreator, e para isso, é necessário o estabelecimento de um protocolo adequado de regeneração e cultura de tecidos (Bornman, 1977; Ma, 2003).

A pneumonia enzoótica ou pneumonia micoplásmica suína (PMS), causada pela bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é uma das principais doenças de suínos. Esta doença acomete animais de todas as idades, sendo a infecção freqüente em todas as regiões do mundo onde a suinocultura é desenvolvida, causando elevadas perdas econômicas. Esta bactéria adere-se aos cílios do epitélio respiratório provocando a sua destruição. A região R1 da adesina P97 é responsável por sua aderência, possuindo grande capacidade imunogênica. As vacinas existentes para PMS são bacterinas que apresentam elevado custo de produção e eficiência limitada (Conceição, 2006). Neste sentido, faz-se necessário a produção de uma vacina efetiva que apresente um custo mais baixo e uma proteção satisfatória.
 Desse modo, o presente estudo teve por objetivo a construção de um vetor de expressão em plantas, contendo a região R1 do gene P97 fusionado à subunidade B da toxina termolábel de Escherichia coli (LTB) - potente adjuvante da imunidade de mucosa - e a transformação de N. tabacum via A. tumefasciens, visando à produção de uma vacina de subunidade recombinante contra a PMS em plantas.

2. MATERIAL E MÉTODOS
Cepas e DNA
O DNA genômico de M. hyopneumoniae cepa 7448, isolado de suíno com PMS, foi gentilmente cedido pelo Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves (CNPSA). O DNA genômico da cepa de E. coli enterotoxigênica (ETEC), isolada de suíno com diarréia, foi obtido no Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). A cepa de A. tumefasciens LBA 4404 foi cedida pelo Departamento de Botânica da Universidade Federal de Pelotas (DB-UFPel). 

Material vegetal
As sementes de N. tabacum variedade K36 adquiridas no DB-UFPel, foram germinadas e cultivadas em meio de Murashige e Skoog (MS) acrescido de 30g/L de sacarose,  7g/L de ágar e 0,5g/L de ácido giberélico (GA3), mantidas em fotoperíodo de 16h e 23+2°C de temperatura, até desenvolvimento de parte aérea e raiz.
 
PCR para fusão ltb-r1
   A região R1 do gene P97 e a subunidade B da toxina termolábel de ETEC foram amplificadas por PCR. Os primers para LTB e R1 foram desenhados baseados nas seqüências depositadas no GenBankTM, cujos números de acesso são M17873 e U50901, respectivamente. Nos primers LTB “reverse” e R1 “forward” foi criado um sítio de restrição para BamHI para manter a fase correta de leitura durante o processo de fusão da região 3’ final da LTB com a região 5’ final do R1. Para realizar a fusão os produtos de PCR foram purificados diretamente do gel de agarose usando o kit GFX Gel band purification (Amershan Biosciences), digeridos com BamHI e ligados com T4 DNA ligase, resultando no híbrido ltb-r1.   No primer LTB “forward” foi inserido um sítio de restrição para XbaI e no R1 “reverse” um para  BglII. 

Clonagem da ltb-r1 no vetor de expressão em planta pGA643 
O vetor binário pGA643 e o gene híbrido ltb-r1 foram digeridos com XbaI e BglII; após a digestão procedeu-se a ligação do inserto ao vetor de expressão em planta pGA643 utilizando a enzima T4 DNA ligase, resultando na molécula recombinante pGA643/ltb-r1 (Figura 1A). Células competentes de E. coli TOP 10F foram transformadas por eletroporação com o produto da ligação e os clones foram selecionados em meio LB contendo 50 µg/ml de canamicina e 5 µg/ml de tetraciclina. Utilizando extração rápida de plasmídio com fenol clorofórmio foi possível identificar os clones recombinantes.  O plasmídio pGA643/ltb-r1 foi caracterizado por PCR e seqüenciamento de DNA.

Transformação de A. tumefasciens 
Células de A. tumefasciens LBA4404 eletrocompetentes foram preparadas e transformadas segundo Brasileiro et al. (1998) com 1µl do plasmídio pGA643/ltb-r1 purificado. Os clones recombinantes foram selecionados em meio YEB contendo 50µg/ml de rifampicina e canamicina e 5µg/ml de tetraciclina. Os clones foram caracterizados através de PCR de colônia utilizando os primers LTB “forward” e R1 “reverse”.

Transformação de N. tabacum 
Entrenós e folhas de N. tabacum foram transformados mediante técnicas de co-cultivo descritas por Brasileiro et al. (1998) e Ferreira (1998). Para a seleção dos recombinantes utilizou-se 30 µg/ml de canamicina.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A região R1 do gene P97 e a subunidade B da enterotoxina termolábel de E. coli foram amplificadas por PCR e resultaram em fragmentos de 270 e 320 pb, respectivamente. A obtenção do híbrido ltb-r1 após a digestão e a ligação dos fragmentos foi eficiente, pois resultou em um produto de aproximadamente 590 pb, confirmado em gel de agarose 0,8%. A clonagem do gene ltb-r1 no vetor pGA643 foi eficiente, pois foi possível identificar em gel de agarose 0,8% a diferença de tamanho entre os plasmídios dos clones recombinantes e não-recombinantes. (Figura 1B). 
A caracterização dos plasmídeos recombinantes foi realizada por PCR, obtendo-se fragmentos de 590 pb, como pode ser observado na Figura 1C. O resultado do seqüenciamento de DNA mostrou que a seqüência estava em fase, comprovando a identidade da proteína a ser expressa. A transformação de A. tumefasciens foi efetiva, obtendo-se um percentual de 80% de recombinantes.
Experimentos preliminares com protocolos de co-cultivo entre explantes de N. tabacum e células de A. tumefasciens (Figura 1D) obtiveram resultados de 20% de regeneração em explantes foliares e 30% nos provenientes de entrenós. Estes ainda se mostram baixos, uma vez que Wei et al. (2006) e Kim et al. (2004), obtiveram em seus experimentos de infecção e co-cultivo com A. tumefasciens, 84,8 e 80,8% de regeneração de explantes, respectivamente. A dose dos antibióticos utilizados (tanto na seleção dos recombinantes, como na eliminação do A. tumefasciens), é um fator determinante no sucesso destes processos, já que doses inadequadas podem tanto inibir a regeneração dos explantes recombinantes, como também ser ineficientes na sua ação bacteriostática (Teixeira da Silva et al., 2003). Isto pode justificar as baixas taxas de regeneração encontradas neste experimento, o que nos sugere que doses diferentes de antibióticos devam ser testadas a fim de aperfeiçoar o processo de regeneração.

4. CONCLUSÕES

O gene ltb-r1 foi clonado no vetor de expressão em plantas pGA643. O vetor pGA643/ltb-r1 foi inserido com sucesso em A. tumefasciens. A transformação e a regeneração dos explantes de tabaco estão em andamento.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BORNMAN, C.H.; SNIJMAN, D.A.; NOEL, A.R.A., ABBOT, J.G. Nicotiana tabacum callus studies.I .Assessment of growth and differenciation.Z. Pflanzenphysiol., 82, 1977, p322-333.
BRASILEIRO, A.C.M. et al. Manual de transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-Cenargen. , 1998, 309p.

CONCEIÇÃO, F.R.; MOREIRA, A.N.; DELLAGOSTIN, O.A. A recombinant chimera composed of R1 repeat region of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin with Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit elicits immune response in mice. Vaccine (aceito para publicação). 2006, 10p.
FERREIRA, A.T. Transformação de batata (Solanum tuberosum L. cvs. Baronesa e Macaca) vias Agrobacterium tumefasciens visando a obtenção de plantas resistentes ao vírus do enrolamento das folhas (PLRV). Dissertação de Mestrado, Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia, FAEM/UFPel, Pelotas. 1998, 112p.
KIM, Y.S.; KWON, T.H.; SIK, Y.M. Direct transfer and expression of human GM-CSF in tobacco suspension cells using Agrobacterium- mediated transfer system. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 78(2), 2004, p133-138.
MA, J.K.; DRAKE, P.M.W.; CHRISTOU, P. Them production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature, 4, 2003, p794-805.
ROBERTS, J.S.; KIRK, D.D. Ethics, biotechnology and global health: the development of vaccines in transgenic plants. Am. J. Bioeth., 6(4), 2006, p29-41.
TEIXEIRA DA SILVA, J.A.; NHUT, D.T.; TANAKA, M.; FUKAI, S. The effect of antibiotics on the in vitro growth response of chrysantemum and tobacco stem transverse thin cell layers (tTCLs). Scientia Horticulturae, 97, 2003, p397-410.
WEI, X.; GOU, X.; YUAN, T.; RUSSEL, S.D. A highly efficient in vitro regeneration system and Agrobacterium-mediated transformation in Plumbago zeilanica. Plant Cell Report, 25, 2006, p513-521.

6. ANEXOS

Figura 1: A - Mapa do vetor recombinante pGA643/ltb-r1. B - Eletroforese em gel de agarose da triagem de clones recombinantes demonstrando a diferença de tamanho entre os plasmídios com e sem inserto (p, plasmídio; r, clones recombinantes). C - Caracterização dos clones recombinantes pela técnica de PCR. D – Regeneração de explante de N. tabacum após co-cultivo com A. tumefasciens transformado.