diagnóstico laboratorial de leptospirose em bovinos: identificação de sorovares prevalentes
RECUERO, Ana Lúcia Coelho1; RECUERO, Rebeca da Cunha1; RASSIER, Gabriela1; BROD, Claudiomar Soares1; FERNANDES, Cláudia Pinho Hartleben1.
1-Centro de Controle de Zoonoses – Departamento de Veterinária Preventiva/Faculdade de Veterinária/UFPel
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900 anarec@pop.com.br

1.	INTRODUÇÃO

A Leptospirose é uma doença comum e economicamente importante que acomete o rebanho bovino em todo o mundo. A leptospirose bovina causa prejuízo econômico pelo aborto, diminuição da produção de leite, infertilidade e morte dos animais (Thiermann, 1984). A enfermidade em rebanho bovino brasileiro foi associada principalmente ao sorogrupo hardjo (Moreira, 1994). 
Novos testes de diagnóstico para a leptospirose tem sido descritos, mas a soroaglutinação microscópica continua sendo o teste de eleição para a identificação de anticorpos anti leptospira nos rebanhos bovinos (Faine et al, 1999, TERRESTRIAL animal health code, 2003).
O propósito deste trabalho foi identificar a prevalência de aglutininas anti leptospiras encontrada em soros bovinos recebidos para diagnóstico no Laboratório de Zoonoses e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (CCZ-UFPEL) no ano de 2005 e relacionar sorovares reagentes e sorovares presentes nas vacinas comerciais disponíveis.

2.	MATERIAL E MÉTODOS
Amostras de Soro
As 396 amostras de soro bovino utilizadas foram recebidas no laboratório do CCZ-UFPEL para diagnóstico de leptospirose. As amostras de sangue total foram submetidas à centrifugação a 3.000 rpm por 5 min, recolhido o soro sobrenadante, identificadas e congeladas a –20˚C até o momento do uso.
Teste de Aglutinação Microscópica (MAT)
Foi utilizada a técnica de aglutinação microscópica (MAT) para a pesquisa de aglutininas anti-Leptospira nas amostras de soros (Faine et al, 1999). Os antígenos utilizados foram 32, cultivados em meio EMJH enriquecido. Nos casos de coaglutinação, o sorovar que apresentou maior título foi considerado como prevalente. O teste foi realizado em placas de microtitulação utilizando cultivos com cinco dias. O título de triagem foi de 100 e soros reagentes foram titulados em diluições dobradas e seriadas, utilizando salina fosfatada pH 7,2 como diluente. O título final do soro foi aquele onde ocorreu a aglutinação de 50 % ou mais do antígeno padrão. A leitura das aglutinações foi realizada em microscópio de campo escuro (Olimpus BX 41) após agitação das placas por 20 min em agitador de placas e incubação por 2 h a 30°C. Nos casos de coaglutinação, o sorovar que apresentou maior título foi considerado como prevalente. O diagnóstico foi realizado no Laboratório de Zoonoses e Saúde Pública, departamento de Medicina Veterinária Preventiva da UFPEL, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil.
Análise dos Dados 
Para a análise dos resultados obtidos foi construído um banco de dados no programa EPI Info, constando de identificação, procedência dos animais, data de coleta de amostras, reatividade na MAT, título de anticorpos dos sorovares reagentes e sorovares presentes nas vacinas comerciais disponíveis.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram analisadas 396 amostras de soro bovino e destes, 191 não reagiram na MAT e 205 apresentaram reação com título de anticorpos igual ou superior a 100. A freqüência de soropositividade na MAT foi de 52,68%. Das amostras reagentes, os sorovares patogênicos prevalentes foram o hardjo cepa hardjoPrajitno (16,6%) com títulos de 100 a 3.200, sorovar hardjo cepa hardjoLely (11,7%) com títulos de 100 a 3.200, sorovar tarassovi (8,8%) com títulos variando entre 100 e 1.600, sorovares shermani, wolffi e sejroe (8,3%) e sorovar pomona 4,9 % com títulos variando de 1:100 a 1:3.200 (Figura 1). O maior número de solicitações de diagnóstico ocorreu no mês de março. 

Figura 1- Sorovares prevalentes detectados em reação com soros bovinos na MAT

A análise dos sorovares reagentes comparados com sorovares contidos nas vacinas comerciais, revelou que dos animais sororeagentes 108 (52,68%) não estariam protegidos, caso fossem vacinados, quando consideradas somente as reações com antígenos pertencentes a sorogrupos não presentes nas vacinas disponíveis (Tabela 2). Entre os sorovares prevalentes não presentes nas vacinas, foram identificados os sorovares tarassovi com 8,8% das reações, sorovares sejroe e shermani representando cada um 8,3% das reações e sorovares isolados locais 81, 206, 49 e 89 representando 13,2% das reações. A leptospirose bovina é freqüentemente causada pela infecção pelo sorovar hardjo, mas também pode ocorrer a infecção por outros sorovares, presentes em localidades distintas no mundo (Faine et al, 1999). Estudos epidemiológicos identificaram a soroprevalência do sorovar hardjo na Europa (Egan, 1986, Pritchard, 1986, Rocha, 2004) e em países da África (Ezeh, 1990, Faine et al, 1999). O sorovar pomona foi identificado no norte da Espanha (Espi, 2000) e no Canadá (Prescott, 1998). Nos Estados Unidos o sorovar hardjo foi o mais prevalente em amostras de soro, tendo sido isolado este sorovar no rebanho bovino (Ellis, et al, 1986). Porém, em estudo mais recente, o sorovar pomona apresentou a maior prevalência seguido do hardjo (Miller et al, 1991). 
Tabela 2- Percentual de reações de soros bovinos na MAT e sorovares presentes e ausentes nas vacinas disponíveis para uso em bovinos.
Sorovares prevalentes reagentes na MAT (%)  	Presente /Ausente Vacinas	
hardjo cepa Hardjoprajitno – 16,6	Sim	
hardjo cepa Lely 607 – 11.7	Sim	
Tarassovi cepa Prelepelitsin- 8,8	Não	
Sejroe cepa M 84 – 8,3	Não	
Wolffi cepa 3705- 8,3	Sim	
Shermani cepa 1342 K- 8,3	Não	
ccz 206 L. Noguchii – 4,4	Não	
ccz 49 L. Noguchii – 4,4	Não	
ccz 81 L. Noguchii – 2,9	Não	
ccz 359 L. Noguchii- 2,4	Não	
ccz 380 L. Noguchii – 2,0	Não	
copenhageni cepa M 20 – 2,0	Sim	
ccz 463  L. Interrogans – 2,0	Não	
ccz 89 L. Interrogans – 1,5	Não	
Icterohaemorrhagiae- cepa RGA – 0,5	Sim	
Grippotyphosa cepa Moskva IV	Sim	

No Brasil, a leptospirose bovina continua apresentando como sorovar mais prevalente o hardjo (49,6%) em bovinos com diminuição da fertilidade (Lilenbaum & Souza, 2003). Em nosso estudo, o sorovar mais prevalente foi o hardjo variante hardjoprajitno (12,7%) porém 9% das reações ocorreram para a variante hardjo Lely e 6,3% para o sorovar wolffi. Segundo trabalho recente, o sorovar hardjo possui variantes sorológicas as quais não devem ser ignoradas quanto a sua importância e inclusão em vacinas utilizadas no rebanho bovino e relatada a importância da utilização da variante sorológica hardjo Norma na identificação de bovinos sororeagentes para leptospirose (Araújo et al, 1998). Ainda, o mesmo estudo sugere que, a utilização do sorovar wolffi é justificada por sua reação cruzada com o sorovar hardjo Norma, pois até o momento, o sorovar wolffi não foi isolado de casos clínicos (Araújo et al, 1998), o que pode justificar a identificação de 70,59% das reações para este sorovar em bovinos do estado de São Paulo (Langoni et al, 2000). Em nosso estudo, prevalências de 8,3% foram identificadas para os sorovares sejroe, shermani e tarassovi, não presentes na composição vacinal, além de um total de 13,2% para sorovares isolados locais, representantes das espécies genômicas L. Interrogans e L. Noguchii.
4. CONCLUSÕES

O sorovar hardjo foi identificado como o mais prevalente nas amostras recebidas para diagnóstico no CCZ-UFPEL, porém o estudo identificou reações de antígenos não constantes nas vacinas disponíveis para bovinos.
5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARAÚJO, V.E.M.; MOREIRA, E.C.; NAVEDA, L.A.B.; SILVA, J.A.; CONTRERAS, R.L. Freqüência de aglutininas anti-Leptospira interrogans em soros sangüíneos de bovinos em Minas Gerais, de 1980 a 2002 Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia, 1998, 50, p. 11-17.
EGAN, J. Leptospira interrogans serovar hardjo in the Republic of Ireland. In: W.A. ELLIS and T.W.A. LITTLE (ed.): Present state of leptospirosis diagnosis and control. Martinus Nijhoff, Dordrecht, The Netherlands 1986, 211.
ELLIS, W. A. and THIERMANN, A. B. Isolation of leptospires from the genital tracts of Iowa cows. American Journal of Veterinary Research, 1986, 47, p. 1694-1696.
ESPI, A.; PRIETO, J. M.; FERNANDEZ, M. AND ALVAREZ, M. Serological prevalence to six leptospiral serovars in cattle in Asturias (Northern Spain). Epidemiology and Infection, 2000, 124, p. 599-602.
EZEH, A. O.; ADDO, P. B.; ADESIYUN, A. A.; BELLO, C. S. AND  MAKINDE, A. A. Serological prevalence of bovine leptospirosis in Plateau State, Nigeria. Revue d Elevage et de Medecine Veterinaire des Pays Tropicaux, 1990, 42, p. 505-508.
FAINE, S.; ADLER, B.; BOLIN, C.; PEROLAT, P. Leptospira and Leptospirosis, p. -296. Medical Science , Melbourne, 1999. Austrália.
FERESU, S. B. Serological survey of leptospiral antibodies in cattle in Zimbabwe. Tropical .Animal Health Production, 1987, 19, p. 209-214.
LANGONI, H.; MEIRELES, L.R.; GOTTSCHALK, S. et al. Perfil sorológico da leptospirose bovina em regiões do Estado de São Paulo. Arquivos do Instituto Biológico, 2000, 67, p. 37-41. São Paulo.
LILENBAUM, W. AND G. N. SOUZA. Factors associated with bovine leptospirosis in Rio de Janeiro, Brazillan. Research in Veterinary Science, 2003, 75, p. 249-25.
MILLER, D. A.; WILSON, M. A. AND BERAN, G. W. Survey to estimate prevalence of Leptospira interrogans infection in mature cattle in the United States. American Journal of Veterinary Research, 1991, 52, p. 1761-1765.
MOREIRA, E.C. Avaliação de métodos para erradicação de leptospiroses em bovinos leiteiros. 93f. Tese (Doutorado)- Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1994.
PRESCOTT, J. F.; MILLER, R. B.; NICHOLSON, V. M.; MARTIN, S. W.; LESNICK, T. Seroprevalence and association with abortion of leptospirosis in cattle in Ontario. Canadian Journal of Veterinary Research, 1998, 52, p. 210-215.
PRITCHARD, D.G. National situation of leptospirosis in the United Kingdom. In: W.A. ELLIS and T.W.A. LITTLE (ed.): Present state of leptospirosis diagnosis and control. Martinus Nijhoff, Dordrecht, The Netherlands, 1986, p.  221-233.
ROCHA, T.; ELLIS, W. A.; MONTGOMERY, J.; GILMORE, C.; REGALLA, J.  AND BREM, S. Microbiological and serological study of leptospirosis in horses at slaughter: first isolations. Research in Veterinary Science., 2004, 76, p. 199-202.
TALPADA, M. D.; GARVEY, N.; SPROWLS, R.; EUGSTER, A. K. AND VINETZ, J. M. Prevalence of leptospiral infection in Texas cattle: implications for transmission to humans. Vector Borne Zoonotic Diseases, 2003, v.3, p. 141-147.
Terrestrial Animal Health Code. On line. Capturado em 15 de agosto de 2006. Disponível na Internet: htttp://www.oie.int/eng/normes/en_mcode.htm., 2003
THIERMANN, A. B. Leptospirosis: current developments and trends. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1984, 184, p. 722-725.