AMPLIFICAÇÃO E CLONAGEM DO GENE EMA-1 DE Babesia equi.

NIZOLI, Leandro Quintana1*; CONCEIÇÃO, Fabrício Rochedo2; SILVA, Sergio Silva3; DELLAGOSTIN, Odir Antonio; LEITE, Fabio Pereira Leite4

1 Aluno de Pós-graduação, Centro de Biotecnologia, UFPel. 
2 Méd. Vet., Centro de Biotecnologia, UFPel.
3  Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária, UFPel.
4 Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto de Biologia, UFPel.
*Universidade Federal de Pelotas (UFPel) – Centro de Biotecnologia.
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-500 Pelotas-RS
e-mail: lqn@pop.com.br

1. INTRODUÇÃO

A babesiose eqüina é uma doença que causa grandes prejuízos à criação eqüina no Brasil. Esta enfermidade pode ser causada por Babesia equi ou B. caballi, protozoários intracelulares que provocam perdas associadas tanto aos fatores clínicos como à restrição ao trânsito internacional de animais soropositivos (FRIEDHOFF, 1990). Nos últimos anos, os estudos sobre o diagnóstico imunológico e vacinação contra B. equi concentraram-se na obtenção de frações antigênicas (KNOWLES et al., 1997). Na membrana externa deste protozoário foram caracterizadas proteínas principais de superfície (equi merozoite antigen-EMAs: EMA-1, EMA-2 e EMA-3). Dentre estas, a EMA-1 (KAPPMEYER et al., 1993) destaca-se como antígeno para diagnóstico em função de sua conservação entre isolados (CUNHA et al., 2002) e por estimular forte resposta humoral com produção de anticorpos específicos em animais infectados (CUNHA et al., 2006; KNOWLES et al. 1991), os quais podem ser detectados por meio de provas sorológicas (XUAN et al., 2001). Seu papel também tem sido caracterizado como um potencial imunógeno, porém nenhuma vacina comercial está sendo utilizada com esta proteína. Com este objetivo o gene EMA-1 de B. equi foi amplificado e clonado em Escherichia coli para posterior expressão em Pichia pastoris.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O isolado UFPel E-12 de B. equi (CUNHA et al., 1998) preservado como estabilizado em nitrogênio líquido, foi utilizado para extração de DNA genômico (SAMBROOK & RUSSELL, 2001). Foram utilizados na reação em cadeia da polimerase (PCR), primers desenhados para amplificar um fragmento esperado de 775 pb, compreendendo todo o gene EMA-1 (Tab. 1). 

 Tabela 1. Seqüência de oligonucleotideos utilizados na amplificação do gene EMA-1 de B. equi.

Primer	Seqüência	
EMA-1 For	5'- CGGAATTCACAAAATGGAGGAGGAGAAACCCAAG-3’	
EMA-1 Rev	5'- GGGGTACCAATAGAGTAGAAAATGCAATG -3'	

O DNA amplificado foi utilizado para ligação ao plasmídeo pPICZαB (Invitrogen), nos sítios EcoRI e KpnI. Células de Escherichia coli TOP10 foram transformadas com o produto da ligação e posteriormente semeadas em meio LB ágar sólido com 100 mg/mL de zeocina e incubadas por 12 horas a 37°C. As colônias contendo o inserto de interesse foram selecionadas após análise por screening por Mini Prep (DELSAL et al., 1988). Os clones foram cultivados em 4 mL de meio liquido LB com zeocina a 37°C, por 12 horas, sob agitação. Os plasmídeos foram purificados com o Kit GFX. Em uma nova etapa do projeto o plasmídeo pPICZαB/EMA-1 será transformado em Pichia pastoris por eletroporação e a expressão induzida com metanol 1%. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O fragmento de 755 pb do gene EMA-1 foi amplificado do DNA de B. equi, mas não foi amplificado com DNA de B. caballi ou com DNA de leucócito de eqüino (Fig. 1).

Figura 1. Eletroforese com gel de agarose 0,8%. Linha 1. marcador de peso molecular (1kb), Linha 2. controle negativo da reação, Linha 3. amplificação com DNA de B. equi, Linha 4. DNA de B. caballi, Linha 5. DNA de leucócitos de eqüinos..

O produto do PCR foi inserido no pPICZαB e então seqüenciado (dados não mostrados). A seqüência do gene EMA-1 da cepa UFPel-E12 foi comparada com aquela do gene EMA-1 de outras cepas de B. equi, tendo em comum um alto grau de homologia (80 a 99%) com gene EMA-1 de todas as outras cepas isoladas de vários países (NICOLAIEWSKY et al. 2001). 
As colônias contendo o inserto de interesse foram selecionadas pelo método Mini Prep (Fig.2). 

Figura 2. Analise pelo método Micro Prep. Seta- as colônias transformantes com o gene EMA-1. 

As colônias de números 1, 3, 6 e 10 foram selecionadas para propagarem os plasmídeos recombinantes. Os plasmídeos foram purificados como Kit GFX (Fig. 3).

Figura 3. Purificação dos plasmídeos pelo Kit GFX.

A ligação do amplicon ao plasmídeo pPICZαB e posterior transformação de células TOP10 permitiu a obtenção de clones contendo o gene EMA-1, os quais serviram de fonte de plasmídeos para transformação e expressão em P. pastoris. 

4. CONCLUSÕES

Durante a interação parasito-hospedeiro, as proteínas de superfície das células são o alvo principal da resposta imune do hospedeiro e os antígenos de superfície do parasito são então alvos coerentes para uso como vacinas de subunidade e reagentes diagnósticos. Até o momento, o potencial de imunidade da EMA-1 em eqüinos não tem sido investigado. Nossa próxima etapa será aperfeiçoar o sistema de expressão em levedura e implementar o processo de imunização de eqüinos para determinar o potencial da EMA-1 como vacina de subunidade.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CUNHA, C. W.; KAPPMEYER, L. S.; McGUIRE, T. C.; DELLAGOSTIN, O. A.; KNOWLES, D. P. Conformational dependence and conservation of an immunodominant epitope within the Babesia equi erythrocyte-stage surface protein equi merozoite antigen 1. Clinical and Diagnostic Laboratory immunology, v. 9, p. 1301-1306, 2002.
CUNHA, C. W.; McGUIRE, T. C.; KAPPMEYER, L. S.; HINES, S. A.; LOPEZ, A. M.; DELLAGOSTIN, O. A.; KNOWLES, D. P. Development of specific immunoglobulin Ga (IgGa) and IgGb antibodies correlates with control of parasitemia in Babesia equi infection. Clinical and Vaccine Immunology, v. 13, p. 297-300, 2006.
CUNHA, C. W.; SILVA, S. S.; OSÓRIO, B. L.; DUTRA, C. L. Alterações hematológicas e sorológicas em eqüinos experimentalmente infectados com Babesia equi. Ciência Rural, v. 28, p. 283-286, 1998.
DELSAL, G.; MANIFIOLETTI, G.; SCHNEIDER, C.  A one-tube plasmid dna mini-preparation suitable for seqeuencing. Nucleic acids research. v.16, p. 9878-9878, 1988.
FRIEDHOFF, K. T. Interaction between parasite and tick vector. International Journal for Parasitology, v.20, n.4, p. 525-535, 1990.
KAPPMEYER, L. S.; PERRYMAN, L. E.; KNOWLES, D. P. Jr. A Babesia equi gene encodes a surface protein with homology to Theileria species.  Molecular and Biochemical Parasitology, v. 62, p. 121-124, 1993.
KNOWLES, D. P. Jr.; PERRYMAN, L. E.; GOFF, W.L.; MILLER, C.D.; HARRINGTON, R.D.; GORHAM, J.R.. A monoclonal antibody defines a geographically conserved surface protein epitope of Babesia equi merozoites.  Infection and Immunity, v. 59, n.7, p.2412-2417, 1991.
KNOWLES, D. P.; KAPPMEYER, L. S.; PERRYMAN, L. E.  Genetic and biochemical analysis of erythrocyte-stage surface antigens belonging to a family of highly conserved proteins of Babesia equi and Theileria species. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 90, p. 69-79, 1997.
NICOLAIEWSKY, T.B.; RICHTER, M.F.; LUNGE, V.R.; CUNHA, C.W.; DELAGOSTIN, O; IKUTA, N.; FONSECA, A.S.; SILVA, S.S.; OZAKI, L.S.. Detection of Babesia equi (Laveran, 1901) by nested polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, v. 10, p. 9-21, 2001.
SAMBROOK, J. & RUSSELL, D.W.  Molecular cloning. A laboratory manual. 3 rd. ed., Cold Spring Harbor, New York, 2001.
XUAN, X.; et al. Expression of Babesia equi Merozoite Antigen 1 in Insect Cells by Recombinant Baculovirus and Evaluation of Its Diagnostic Potential in an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Clinical Microbiology, v. 39, p. 705–709, 2001.