IMUNOGENICIDADE DE BCG RECOMBINANTE EXPRESSANDO A REGIÃO R1 DA ADESINA P97 DE Mycoplasma hyopneumoniae

GRASSMANN, André A1; ROCHA, Andréa R1; MORAES, Carina M2; DELLAGOSTIN, Odir A1, 3; CONCEIÇÃO, Fabricio R2,4

1. Laboratório de Biologia Molecular – CenBiot  – UFPel
2. Laboratório de Bacteriologia – CenBiot – UFPel
3. Instituto de Biologia - UFPel
4. Faculdade de Veterinária - UFPel
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. andreg.ib@ufpel.edu.br

1. INTRODUÇÃO

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), uma doença infecciosa crônica altamente contagiosa. Esta doença acomete suínos de todas as idades, sendo mais comum nos animais da fase de crescimento e terminação. Apresenta ampla distribuição e alta morbidade (Straw et al., 1989). M. hyopneumoniae coloniza o epitélio ciliado das vias aéreas provocando a destruição dos cílios, predispondo os animais a infecções secundárias (Ciprian et al., 1994), que por sua vez agravam o quadro clínico, resultando em piora na conversão alimentar, perda de peso e aumento da mortalidade.
A prevenção através de vacinas apresenta-se como a melhor alternativa para o controle da PES, porém, as bacterinas disponíveis no mercado possuem eficiência limitada e alto custo de produção em função das exigências nutricionais de M. hyopneumoniae (Lin et al., 2003). Neste contexto, o desenvolvimento de vacinas recombinantes destaca-se. Com este fim, Conceição et al. (2006) construíram uma vacina recombinante composta pela região R1 da adesina P97 de M. hyopneumoniae, um antígeno imunodominante e importante na patogenia da doença, fusionada à subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB), um potente adjuvante da imunidade de mucosa (Verweij et al., 1998). A quimera rLTBR1 induziu em camundongos resposta imune local, sistêmica e celular contra a região R1 da P97 (Conceição et al., 2006).
Mycobacterium bovis BCG apresenta propriedades imunoestimulantes, sendo um excelente candidato à vacina recombinante vetorizada. BCG estimula resposta imune celular e humoral, é seguro, estável e de fácil propagação. Além disso, é a vacina mais utilizada no mundo e diversos estudos comprovaram seu potencial em expressar antígenos heterólogos (Ohara & Yamada, 2001; Rapeah & Norazmi, 2006). O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta imune humoral de camundongos vacinados com BCG recombinante (rBCG) expressando a região R1 da adesina P97, sozinha (rBCG/R1) ou fusionada à LTB (rBCG/LTBR1).

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Os genes r1 e ltbr1 foram clonados nos vetores de expressão citoplasmática em micobactérias pUS2000, pUS977 e pAU5 (Lagranha et al., 2005), cujos promotores são, respectivamente, 18 kDa de M. leprae, pAN de M. paratuberculosis e HSP60 de M. bovis. A expressão das proteínas recombinantes em BCG foi analisada por Western blot utilizando anticorpo monoclonal (MAb) anti-R1 e conjugado anti-Igs totais de camundongo (Sigma).
Na avaliação da imunogenicidade dos rBCG, foram utilizados 35 camundongos isogênicos BALB/c, de ambos os sexos e com idade entre 6 e 8 semanas. Grupos de 5 animais foram formados: grupo 1 - rBCG pUS977/R1, grupo 2 - rBCG pUS977/LTBR1, grupo 3 - rBCG pUS2000/R1, grupo 4 - rBCG pUS2000/LTBR1, grupo 5 - rBCG pAU5/R1, grupo 6 - rBCG pAU5/LTBR1 e grupo 7 - BCG Pasteur. Doses contendo 106 rBCG ou BCG Pasteur, em 100 mL de PBS, foram administradas por via intraperitonial nos dias 0 e 21. Coletas de soro foram realizadas nos dias 0, 21, 42, 63, 84, 114, 144, 174 e 240.
A quantificação de anticorpos anti-R1 no soro dos animais vacinados foi feita através de ELISA indireto utilizando microplacas sensibilizadas com rR1. Pool de soro dos animais de cada grupo, diluído 50x e conjugado anti-Igs totais de camundongo (Sigma), diluído 3000x, foram utilizados no ensaio. Após a adição do substrato, as absorbâncias (DO450) foram determinadas em leitor de ELISA. As absorbâncias foram transformadas em soroconversões dividindo as absorbâncias de cada amostra pela absorbância média do dia zero de todos os animais. As médias das soroconversões de cada grupo foram submetidas à análise de variância. O teste t de Student’s foi utilizado para determinar diferenças significativas (p<0.05). O pool de soro (dias 0 e 84) dos animais vacinados foi testado por Western blot utilizando rR1 e rLTB purificadas ou extrato da cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A expressão in vitro da rR1 e rLTBR1 em rBCG foi confirmada mediante Western blot com MAb anti-R1. Os três vetores utilizados apresentaram nível de expressão similar, portanto, in vitro, não houve diferenças entre os promotores.
A figura 1 mostra as soroconversões de anticorpos sistêmicos anti-R1 dos grupos experimentais. Todos os grupos inoculados com rBCG produziram anticorpos anti-R1 (p<0,05 em relação ao grupo controle), demonstrando que a vacina recombinante foi imunogênica para os camundongos. O grupo controle não estimulou a produção de anticorpos anti-R1. Uma dose de rBCG foi capaz de induzir a produção de anticorpos anti-R1 e para todos os grupos, o pico de anticorpos anti-R1 ocorreu no dia 42. Com exceção do rBCG pUS977/R1 e rBCG pUS977/LTBR1, que mostraram uma tendência de declínio dos anticorpos no final do experimento, o nível de anticorpos anti-R1 manteve-se estável até o dia 240, corroborando que rBCG é capaz de induzir imunidade duradoura. As soroconversões mostraram que o nível de expressão das proteínas recombinantes, in vivo, também foi similar, portanto não havendo diferenças entre os promotores avaliados.
Comparando os vetores com e sem LTB, apenas o rBCG pUS2000/LTBR1 apresentou soroconversão superior (p<0,05) ao rBCG pUS2000/R1 (cerca de 7,5x contra 5,5x) no dia 42, sugerindo um efeito coadjuvante para a LTB (Figura 1 A). rBCG pAU5/LTBR1 e rBCG pAU5/R1 induziram soroconversões semelhantes (Figura 1 B), enquanto que rBCG pUS977/R1 induziu soroconversões maiores que rBCG pUS977/LTBR1 (Figura 1 C), porém esta diferença não foi significativa (p>0,05). 
A análise de Western blot evidenciou que apenas o pool de soro dos animais vacinados com rBCG reconheceu a P97 da cepa 7448 bem como a rR1 ou rLTB-R1 (Figura 2), sugerindo que os anticorpos sistêmicos anti-R1 foram induzidos pela vacinação. Hsu & Minion (1998) demonstraram que anticorpos anti-R1 inibem a adesão de M. hyopneumoniae ao epitélio ciliado das vias aéreas, minimizando, conseqüentemente a patologia. Neste âmbito, nossos resultados indicam que rBCG expressando a R1 pode ser um candidato eficaz na prevenção da PES.

Figura 1. Soroconversões de anticorpos sistêmicos anti-R1 determinadas através de ELISA. A- pool de soro dos animais imunizados com rBCG pUS2000/R1 e LTBR1; B- rBCG pAU5/R1 e LTBR1; C- BCG pUS977/R1 e LTBR1. As soroconversões induzidas pelos rBCG podem ser comparadas com às induzidas pelo BCG Pasteur (grupo controle).

 

4. CONCLUSÃO

  1   2    3   4    5    6    7   8    9

1    2    3     4   5     6    7   8    9

rR1

(B)

rLTB-R1

(A)

Figura 2 – Western blot do pool dos soros dos grupos experimentais (A) rLTB-R1 purificada - coluna 1 – pool dia 0 rBCG pUS977/LTB-R1, 2 - pool dia 84 rBCG pUS977/LTB-R1, 3 - pool dia 0 rBCG pUS2000/LTB-R1, 4 - pool do dia 84 rBCG pUS2000/LTB-R1, 5 - pool dia 0 rBCG pAU5/LTB-R1, 6 - pool dia 84 rBCG pAU5/LTB-R1, 7 - pool dia 84 BCG Pasteur, 8 - pool dia 84 Salina, 9 – Mab anti-R1 (1:500). (B) rR1 purificada - coluna 1 – pool dia 0 rBCG pUS977/R1, 2 - pool dia 84 rBCG pUS977/R1, 3 - pool dia 0 rBCG pUS2000/R1, 4 - pool dia 84 rBCG pUS2000/R1, 5 - pool dia 0 rBCG pAU5/R1, 6 - pool dia 84 rBCG pAU5/R1, 7 - pool dia 84 BCG Pasteur, 8 – pool dia 84 rR1, 9 – Mab anti-R1 (1:500).

4. CONCLUSÃO

A vacina recombinante composta por rBCG/LTBR1 ou rBCG/R1 induziu nos camundongos a produção de anticorpos séricos anti-R1, os quais reconheceram a P97 da cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae.  rBCG pUS2000/LTBR1 induziu as maiores soroconversões, sugerindo um efeito coadjuvante para a LTB. Estes resultados encorajam a realização de novos experimentos com rBCG/R1 e rBCG/LTBR1, visando a avaliação da resposta imune local e celular, avaliação de vias de administração (oral e nasal) e avaliação da imunogenicidade e eficácia de proteção em suínos. 

5. REFERÊNCIAS

CIPRIAN A., CRUZ T.A. & DE LA GARZA M. Mycoplasma hyopneumoniae:  interaction with other agents in pigs, and evaluation of immunogens. Arch. Med. Res., 1994, 25:235-239.
CONCEIÇÃO, F. R.; MOREIRA, A. N.; DELLAGOSTIN, O. A. A recombinant chimera composed of R1 repeat region of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin with Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit elicits immune response in mice. Vaccine, 2006, v. 24, p. 5734-5743. 
HSU, T., MINION, C. Identification of the Cilium Binding Epitope of the Mycoplasma hyopneumoniae P97 Adhesin. Infection and Immunity. 1998, 66, n. 10, p. 4762-4766. 
LAGRANHA, V. 2005. Construção de vetores de expressão em Mycobacterium bovis BCG contendo a região r1 da adesina P97 de Mycoplasma hyopneumoniae. Monografia (Conclusão de Curso de Ciências Biológicas – Bacharelado) – Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil.
LIN, J.H., WENG, C.N., LIAO, C.W., YEH, K.S., PAN, M.J. Protective effects of oral microencapsuled Mycoplasma hyopneumoniae vaccine prepared by co-spray drying method. J Vet Med Sci, 2003, v. 65, p. 69-71. 
OHARA, N. & YAMADA, T. Recombinant BCG vaccines. Vaccine, 2001, v.19, p. 4089-4098. 
RAPEAH S., NORAZMI M.N. Immunogenicity of a recombinant Mycobacterium bovis bacilli Calmette–Gu`erin expressing malarial and tuberculosis epitopes. Vaccine, 2006, v. 24, p. 3646-3653.
STRAW, B. E., TUOVINEN V. K., BIGRAS-POULIN M.. Estimation of the cost of pneumonia in swine herds. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1989, v.195, n. 12, p.1702-1706.
VERWEIJ, W.R.; HAAN, L.; HOLTROP, M. Mucosal immunoadjuvant activity of recombinant Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit: Induction of systemic IgG and secretory IgA responses in mice by intranasal immunization with influenza virus surface antigen. Vaccine, 1998, v. 6, p. 3476-3482.