AVALIAÇÃO DE MECANISMOS PARA EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA TOXINA α DE Clostridium perfringens

GIL de los SANTOS, João Rodrigo1; BATTISTI, Luciano de Oliveira2;
 CONCEIÇÃO, Fabrício Rochedo3; GIL-TURNES, Carlos4

1 Doutorando, Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Agrícola. CENBIOT/UFPel. gildelossantos@uol.com.br
2 Graduando. Bolsista de Iniciação Científica. Faculdade de Veterinária e CENBIOT/UFPel
3 Dr, Bolsista ProDoc - CAPES. Faculdade de Veterinária e CENBIOT/UFPel
4 Professor Dr, Faculdade de Veterinária e CENBIOT/UFPel

1. INTRODUÇÃO
	
A Enterite Necrótica das aves (ENA) é uma enterotoxemia aguda, produzida pela toxina  de Clostridium perfringens A e C (Ontario Ministry of Agriculture, 2003), caracterizada por surgir subitamente, com necrose da parede intestinal e elevada mortalidade nas duas primeiras horas de manifestação (Chang et al., 2004), principalmente em pintos de 16 a 18 dias de idade (Phillips, 2006). O controle é feito com doses subterapêuticas de antibióticos nas rações. Porém, com a proibição da utilização de antibióticos como suplementos alimentares pela União Européia (European Commission, 2003), a partir de 2006, e as restrições impostas pelos EUA e Japão quanto a essa prática, a ENA passou a ser a doença bacteriana mais comum em aviários (Phillips, 2006) e um dos maiores desafios para o futuro da avicultura mundial (Sesti, 2002; Kaldhusdal, 2004). Assim, é necessário adotar novas estratégias de controle. Probióticos e vacinas estão entre as mais promissoras, ambos com resultados contraditórios. A obtenção industrial de toxina  de C. perfringens para utilização como antígeno vacinal, pelos métodos clássicos, envolve tecnologia e processos dificultosos (Ito, 1968). A utilização de tecnologia recombinante na expressão de proteínas heterólogas mostra-se como uma alternativa viável para a produção de vacinas eficientes em processos simples. Uma das opções é a Pichia pastoris, uma levedura que sintetiza várias proteínas heterólogas em altas concentrações. O objetivo deste trabalho foi avaliar a clonagem e a expressão do gene da toxina  de C. perfringens em Escherichia coli e P. pastoris.

2. MATERIAL E MÉTODOS

 Uma cepa de C. perfringens A isolada de um caso de ENA foi cultivada a 37ºC durante a noite em meio de carne cozida de Robertson com 1% de glicose.  Foi extraído o DNA cromossomal conforme Sambrook & Russel (2001). Foram desenhados primers específicos para o gene da toxina α a partir da seqüência depositada no GenBank (número de acesso 896255), no programa Vector NTI 8.0 (Informax, InvitrogenTM, USA). O gene foi amplificado por PCR, purificado com o kit GFX (GE Healthcare, USA), digerido com XhoI e HindIII e clonado no vetor de expressão pAE em E. coli (Ramos et al., 2004) com T4 DNA Ligase (InvitrogenTM). E. coli TOP10F competente (InvitrogenTM) foi transformada por eletroporação com o produto da ligação e os clones recombinantes selecionados em ágar Luria-Bertani (LB) contendo 100g/mL de ampicilina. A triagem das colônias recombinantes foi feita com fenol clorofórmio segundo Jouglard et al. (2002). Os clones foram repicados em LB com ampicilina, os plasmídeos extraídos segundo Sambrook & Russel (2001) e caracterizados por digestão com XhoI e HindIII. E. coli BL21 DE3 pLYS transformada com os vetores recombinantes, foi cultivada em 10mL de LB com ampicilina até a fase log (DO600=0,6-0,8), sendo 5mL desta cultura induzida com IPTG 1mM durante 3 h. Os extratos das culturas foram analisados por SDS-PAGE 12% utilizando como controle a TOP10F e os 5mL restantes dos cultivos que não foram induzidos. 
Para a expressão em P. pastoris foi usado o plasmídeo de expressão pPICZαB (InvitrogenTM). O gene, amplificado por PCR, foi digerido com EcoRI e KpnI, e clonado no pPICZαB, previamente digerido com essas enzimas, por ligação com T4 DNA Ligase. E. coli TOP10F competente foi transformada por eletroporação com o produto da ligação e os clones recombinantes selecionados em LB low salt contendo 25g/mL de zeocina. Um clone foi caracterizado e propagado para extração do plasmídeo pPICZαB/toxina α. P. pastoris KM71H competente foi transformada por eletroporação com 30g de pPICZαB/toxina α, os clones recombinantes selecionados em YPDS contendo 100g/mL de zeocina e caracterizados por PCR. Um clone foi selecionado para o teste de expressão em pequena escala em agitador orbital (30C e 200 rpm). Após a cultura em meio BMGY ter atingido DO600=5, o cultivo foi centrifugado a 1000xg durante 10 min para obtenção do pelet celular, que foi ressuspenso a uma DO600=1 em BMMY com 0,5% de metanol. Diariamente, durante quatro dias, o cultivo foi induzido com 0,5% de metanol e uma amostra do sobrenadante coletada, para a detecção da toxina α mediante Western blot com anticorpo monoclonal (MAb) anti-histidina conjugado a peroxidase (Sigma, USA).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A

A Figura 1 ilustra os plasmídeos construídos. Após a clonagem, notou-se a diferença de tamanho entre os vetores recombinantes e não recombinantes (Figura 2). 

B

                                                                                                                                                                                                             

Figura 1. Mapas dos plasmídeos construídos. A- plasmídeo de expressão em E. coli pAE/toxina α; B- plasmídeo de expressão em P. pastoris pPICZαB/toxina α.

Figura 2. Eletroforese em gel de agarose 0,8%. Triagem das colônias recombinantes. 1- pAE purificado; 2 e 9- clones recombinantes (pAE/Toxina α); 3, 8 e 10- clones não recombinantes (pAE).
A confirmação dos clones recombinantes foi feita por digestão com enzimas de restrição. Os vetores liberaram um fragmento acerca de 1120pb, correspondente ao gene da toxina α. No SDS-PAGE 12% (Figura 3), os clones recombinantes de E. coli, induzidos ou não, expressaram uma proteína de aproximadamente 42 kDa, compatível com a massa molecular da toxina α, mostrando que houve vazamento na expressão. A quantidade de toxina produzida após a indução foi bastante significativa, sugerindo que a proteína recombinante não foi tóxica para E. coli.

Figura 3. SDS-PAGE 12%. Detecção da expressão de toxina α em E. coli BL21 DE3 pLYS transformada com o plasmídeo pAE/toxina α. 1- proteína purificada de 45 kDa; 2- E. coli BL21 DE3 pLYS; 3- E. coli BL21 DE3 pLYS-pAE/toxina α clone 1 não induzido; 4- E. coli BL21 DE3 pLYS-pAE/toxina α clone 1 induzido; 5- E. coli BL21 DE3 pLYS-pAE/toxina α clone 2 não induzido; 6- E. coli BL21 DE3 pLYS-pAE/toxina α clone 2 induzido.

Sete transformantes de P. pastoris KM71H foram obtidos, sugerindo uma baixa eficiência de integração com o vetor circular. Uma PCR confirmou que todos os clones eram recombinantes. Além disso, a PCR sugeriu que o pPICZαB/toxina α integrou-se no genoma da Pichia, uma vez que este vetor não possui origem de replicação de levedura. Não houve amplificação com DNA de P. pastoris KM71H. O clone 7 foi selecionado para avaliação da expressão em pequena escala. No Western blot (Figura 4), detectou-se a toxina α, acerca de 42 kDa, 24 h após indução com metanol, porém a maior produção ocorreu após 96 h. Estes resultados mostraram que P. pastoris KM71H recombinante secretou eficientemente uma proteína de aproximadamente 42 kDa, que foi reconhecida pelo MAb anti-histidina. Nenhuma banda foi detectada no sobrenadante de cultura de KM71H após 96 h de indução.

Figura 4. Western blot com MAb anti-histidina conjugado a peroxidase. Detecção de toxina α no sobrenadante da cultura de P. pastoris KM71H transformada com o plasmídeo pPICZαB/toxina α após indução com 0,5% de metanol. 1- Sobrenadante de cultura de KM71H recombinante após 48 h de indução; 2- Sobrenadante de cultura de KM71H recombinante após 72 h de indução; 3- Sobrenadante de cultura de KM71H após 96 h de indução.
 
Os resultados obtidos sugerem que a produção da toxina α de Clostridium perfringens em E. coli ou P. pastoris recombinante pode ser uma alternativa à tecnologia clássica de sua obtenção a partir de cultivos da bactéria em anaerobiose. Ao contrário da expressão citoplasmática em E. coli, a secreção de toxina α por P. pastoris facilita a sua purificação, reduzindo o custo de produção da vacina. 

4. CONCLUSÕES

O gene que codifica a toxina α de C. perfringens foi clonado nos plasmídeos pAE e pPICZαB, de expressão em E. coli e P. pastoris, respectivamente. E. coli BL21 DE3 pLYS recombinante expressou eficientemente a toxina α de C. perfringens. P. pastoris KM71H recombinante secretou eficientemente a toxina α de C. perfringens.

5. AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado pela FAPERGS (Auxílio 0523299) e pelo CNPq (Auxílio 474509/2004-4).

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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JOUGLARD, S.D.; MEDEIROS, M.A.; VAZ, E.K.; BASTOS, R.G.; CUNHA, C.W.; ARMOA, G.R.G.; DELLAGOSTIN, O.A. An ultra-rapid and inexpensive plasmid preparation method for screening recombinant colonies. In: 102nd MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, Salt Lake City, 2002. Abstracts... Washington DC; American Society for Microbiology, 2002, v.1., p.234-234.
KALDHUSDAL, M. (2004). Maintaining gut health in meat-type poultry without antibacterial growth promoters and ionophores. Disponível em: <http://www-afac.slu.se/WPSA%20Lillehammer%20Magne.pdf>. Acesso em: 21 jan. 2004.
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