CONSTRUÇÃO DE UMA QUIMERA RECOMBINANTE 
FORMADA PELA FUSÃO DE PROTEÍNA M DE Streptococcus equi E A SUBUNIDADE B DA ENTEROTOXINA TERMOLÁBIL de Escherichia coli CANDIDATA A VACINA CONTRA ADENITE EQUINA

MORAES, Carina Martins1; PEREIRA, Cleonice Rodrigues2*; ROCHA, Andréa da Silva Ramos1; DUMMER, Luana Alves 1; CONCEIÇÃO, Fabrício Rochedo3; LEITE, Fábio Pereira Leivas5;
NOGUEIRA, Carlos Eduardo Wayne 4; GIL-TURNES, Carlos4.	

 Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Agrícola, CENBIOT/UFPel.*  moraescm@ufpel.tche.br; 2* Bolsista de Iniciação científica, CENBIOT/UFPel; 3 Dr, Bolsista ProDoc - CAPES. Faculdade de Veterinária, UFPel ; 4 Professor Dr Faculdade de Veterinária, UFPel; 5 Professor Dr Instituto de Biologia, UFPel

1.	INTRODUÇÃO

A Adenite Eqüina, também conhecida como Garrotilho, é uma doença amplamente difundida e de grande importância econômica na eqüinocultura mundial. (KOWALSKI et al, 1993), causada pela bactéria Streptococcus equi. Seu principal fator de patogenicidade é a proteína M, de 58 KDa, que tem propriedades antifagocítica e de aderência e é codificada pelo gene SeM. Por se tratar de uma estrutura específica da espécie, a proteína vem sendo utilizada para diagnóstico, e é um promissor antígeno vacinal para o Garrotilho (HARRINGTON et al, 2002; ANZAI et al, 1999; TIMONEY et al, 1997). 	
Os programas de vacinação contra Garrotilho não permitem um eficiente controle da enfermidade em condições de campo (TIMONEY, 1993), já que não mais que 50% dos animais vacinados ficam imunes. Mesmo a imunização não induzindo resistência populacional aceitável, os animais imunizados respondem muito mais rápido e com níveis mais altos de anticorpos circulantes que de anticorpos de mucosa quando infectados por S. equi (SWEENEY, 1993; KOWALSKI, 2000; PRESCOTT & WRIGTH, 2000). O baixo índice de proteção conferido pelas vacinas pode dever-se, em parte, à inadequada estimulação antigênica, ou porque a proteção dos eqüinos não seja mediada por anticorpos bactericidas séricos, mas por imunoglobulinas secretórias da mucosa nasofaríngea produzidas localmente (SWEENEY, 1993).
Nesse contexto, o uso de adjuvantes que incrementam a imunidade de mucosa tem sido alvo de estudo por diversos pesquisadores (HARRINGTON et al., 2002). Uma alternativa possível, com o advento da tecnologia de DNA recombinante, é a fusão de adjuvantes imunológicos a antígenos específicos, produzindo quimeras que podem ser utilizadas como vacinas. Dentre os adjuvantes de mucosa que vem sendo estudados, uma nova classe, representada pela subunidade B da enterotoxina termolábil de Vibrio cholerae e Escherichia coli (CTB e LTB, respectivamente), vem se destacando. Estas subunidades atóxicas são potentes adjuvantes da imunidade de mucosa, estimulando uma forte resposta sistêmica e secretória de anticorpos contra antígenos co-administrados (VERWEIJ et al, 1998).
Este trabalho teve por objetivo fusionar a proteína M de Streptococcus equi ao fragmento B da toxina termolábil de E. coli, produzindo uma quimera recombinante que possa posteriormente ser utilizada como alternativa para vacinação contra Adenite Eqüina.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Cepas de S. equi e E. coli foram isoladas, caracterizadas e seus respectivos DNA cromossomais extraídos. Primers específicos para os genes de interesse foram desenhados a partir de seqüências depositadas no GeneBank, com a utilização do programa VectorNTI 8.0 (Informax Inc.). Após amplificação, o gene LTB foi clonado no vetor pAE, entre os sítios de restrição BamHI e KpnI. A seguir, o gene SeM foi clonado em fase com o ltb entre os sítios KpnI e HindIII, formando o gene híbrido ltb-SeM. 
Cepas de E. coli competentes TOP 10 F (Invitrogen) foram transformadas com o vetor pAE/ltb-SeM através de eletroporação. Os clones recombinantes foram selecionados em meio LB contendo 100 µg/ml de ampicilina. A triagem das colônias foi feita com fenol clorofórmio, segundo técnica descrita por JOUGLARD et al., (2002). Os clones recombinantes foram propagados em LB com ampicilina, e os plasmídeos extraídos com o kit GFX (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante. 
 E. coli BL21 DE3 Star competente foi transformada visando a expressão da quimera rLTB/SeM. Os clones recombinantes foram cultivados em 10 mL de LB com ampicilina até a fase log de crescimento (DO600=0,6-0,8), sendo 5 mL desta cultura induzida com 1 mM IPTG durante 3 h, e os 5 mL restantes utilizados como controle (não induzido). As amostras foram submetidas a SDS-PAGE 12%, utilizando pellets de 1 mL das culturas. Western blot utilizando anticorpo monoclonal anti-histidina (Sigma) foi realizado para confirmar a expressão da quimera recombinante. 
 
3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Figura 1 mostra o mapa do vetor de expressão em E. coli pAE/ltb-SeM. A primeira clonagem foi do gene ltb e posteriormente, em seqüência, fusionou-se o gene SeM, mantendo a fase de leitura. O vetor pAE possui em sua estrutura uma cauda de 6 histidinas, que possibilita a purificação da proteína de interesse por cromatografia de afinidade e a sua detecção por Western blot com MAb anti-histidina.

Figura 1: Mapa do vetor pAE/ltb-SeM.

A figura 2 ilustra as amplificações por PCR do gene SeM (1600 pb) e do gene ltb (320 pb).

 1     2      3      4       5      6  

564 pb

  2.027 pb

Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 0,8% demonstrando os produtos da PCR, onde: 1, marcador de massa molecular  Hind III (em destaque bandas de 2.027 pb e 564pb); 2, 3 e 4, amplificação do gene ltb; 5 e 6, amplificação do gene SeM .

 A Figura 3 mostra o resultado da triagem das colônias recombinantes após a clonagem em TOP 10 F, onde foi possível observar em gel de agarose 0,8% a diferença de tamanho entre os plasmídeos recombinantes e não recombinantes.

1     2      3    4    5    6   7    8     9    10  11  12  13    

Figura 3: Gel de agarose 0,8%. 1, pAE (controle); 2 a 12, clones recombinantes; 13, clone não recombinante.

Na Figura 4 A (linha 5) é possível observar uma banda de aproximadamente 70 KDa, compatível com o tamanho esperado da quimera rLTB-SEM. Os outros três clones recombinantes não expressaram a quimera rLTB-SeM. A confirmação da quimera foi feita por Western blot com MAb anti-histidina (Figura 4 B, linha 5), onde o MAb reconheceu uma proteína de aproximadamente 70 kDa.

60 KDa

B    1    2    3   4     5    6   7   8    9   10

LTB/M

LTB/M

60 KDa

A     1   2   3    4    5   6    7   8    9  10

Figura 4: A, SDS PAGE da expressão em pequena escala da quimera LTB/SeM. 1, Star (controle negativo); 2, 4, 6 e 8, cultivos não induzidos de clones recombinantes; 5, 7 e 9, cultivos induzidos dos clones recombinantes; 10, proteína de 60 KDa. B, Western blot com MAb anti-histidina, sendo que a ordem das amostras é a mesma do painel A.

4. CONCLUSÕES

Concluiu-se que foi possível amplificar, clonar, fusionar e expressar a quimera rLTB-SeM em E. coli. A partir destes resultados, a imunogenicidade desta quimera será avaliada em camundongos BALB-c isogênicos.

6 . Referências bibliográficas

ANZAI, T; TIMONEY, J.F; KUWAMOTO, Y; FUJITA, Y; WADA, R; INOUE, T. In vivo pathogenicity and resistance to phagocytosis of Streptococcus equi strains with different levels of capsule expression. Veterinary Microbiology v.67, p.277-286, 1999.
BONNISTER, M.F.; BENSON, C.E.; SWEENEY, C.R. Rapid species identification of group C streptococci isolated from horses. Journal of Clinical Microbiology v.21, p. 524-526, 1985.
HARRINGTON, D.J; SUTCLIFFE, I.C; CHANTER, N. The molecular basis of Streptococcus equi infection and disease. Microbes and Infection v.4, p.501-510, 2002.  
JOUGLARD, S.D.; MEDEIROS, M.A.; VAZ, E.K.; BASTOS, R. G.; DA CUNHA, C.W.; ARMOA, G.R.G.; DELLAGOSTIN, O.A. An Ultra-Rapid and Inexpensive Plasmid Preparation Method for Screening Recombinant Colonies. Abstracts American Society for Microbiology. H-71, p. 234, 2002.
KOWALSKI, J.J. Mecanismo da Doença Infecciosa. In: REED, S.M.; BAYLY, W.M. Medicina Interna Eqüina. Rio de Janeiro : Rio de Janeiro, 2000, pP.54-56.
KUWAMOTO, Y.; ANZAY, T.; WADA, R. Microplate sugar-fermentation assay distinguishes Streptococcus equi from other streptococci of Lancefield’s group C. Equine Veterinary Science. v.12, n. 2, p. 47-49, 2001.
SWEENEY, C.R. Streptococcus equi. In: SMITH, B.P. Tratado de Medicina Interna de Grandes Animais. Editora Manole LTDA, São Paulo, p.531-533, 1993. 
TIMONEY, J.F; ARTIUSHIN, S.C; BOSCHWITZ, J.S. Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-like proteins SeM and SzPSe. Infection and Immununity n. 65, p. 3600-3605, 1997.
VERWEIJ, W.R.; HAAN, L.; HOLTROP, M.; et al. Mucosal immunoadjuvant activity of recombinant Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit: Induction of systemic IgG and secretory IgA responses in mice by intranasal immunization with influenza virus surface antigen. Vaccine,n.16, p. 3476-3482, 1998.