LEPTOSPIROSE EM PROPRIEDADE RURAL DO MUNICÍPIO DE PELOTAS INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA E ISOLAMENTO DE Leptospira sp 
FERNANDES, Cláudia Pinho Hartleben1; RECUERO, Rebeca da Cunha1; RECUERO, Ana Lúcia Coelho1; RASSIER, Gabriela1; BROD, Claudiomar Soares1.
1Centro de Controle de Zoonoses – Faculdade de Veterinária/UFPel
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1.	INTRODUÇÃO

A leptospirose é uma zoonose que ocorre na maioria dos mamíferos e, o agente etiológico é a bactéria do gênero Leptospira, sendo essa já isolada de répteis, anfíbios e peixes (Faine et al., 1999). 
A enfermidade pode apresentar-se variando de um quadro clínico semelhante à gripe comum até a forma grave com falência renal e hepática (Faine et al., 1999). Entre as profissões de risco associadas à doença, foram relatadas a de médico veterinário, tratador de animais, agricultor (Levett, 2001), magarefes e funcionários da limpeza pública (Almeida et al., 1994) 
O presente trabalho descreve a investigação em uma propriedade rural a partir de um caso humano de leptospirose, tendo sido realizada a coleta de amostras de sangue e urina dos animais para diagnóstico sorológico e isolamento de Leptospira e de água para o consumo humano.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Caso Humano de Leptospirose
O diagnóstico da amostra humana foi realizada através do teste de aglutinação microscópica (MAT). A solicitação de diagnóstico foi enviada ao laboratório do CCZ-UFPEL no dia 21 de julho de 2006 o médico responsável pelo paciente iniciou o tratamento no dia seguinte. 
2.2. Amostras de soro
As amostras de sangue total da espécie humana e animal foram submetidas à centrifugação a 3.000 rpm por 5 min, recolhido o soro sobrenadante, identificadas e processadas imediatamente ou congeladas a –20˚C até o momento do uso.
2.3. Semeadura em meio de cultura para isolamento de Leptospira
Foi utilizado o meio de Ellinghausen e McCullough, modificado por Johnson e Harris (EMJH) enriquecido com 10% de albumina bovina (Faine et al., 1999). As amostras utilizadas (para inoculo) foram urina bovina e rins de roedores capturados na propriedade.
2.4. Teste de Aglutinação Microscópica (MAT)
Foi utilizada a técnica de aglutinação microscópica (MAT) para a pesquisa de aglutininas anti-Leptospira nas amostras de soros (Faine et al., 1999). Foram utilizados 45 sorovares, cultivados em meio EMJH enriquecido. O teste foi realizado em placas de microtitulação utilizando cultivos com cinco dias. O título de triagem foi de 100 para animais e de 50 para humanos. Os soros reagentes foram titulados em diluições dobradas e seriadas, a partir do título inicial, utilizando salina fosfatada, pH 7,2, como diluente. O título final do soro foi aquele onde ocorreu aglutinação de 50 % ou mais do antígeno. A leitura das aglutinações foi realizada em microscópio de campo escuro (Olimpus BX 41), após agitação das placas por 20 min em agitador de placas e incubação por 2 h a 30°C. O diagnóstico foi realizado no Laboratório de Zoonoses e Saúde Pública, departamento de Medicina Veterinária Preventiva da UFPEL, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. 
2.5. Análise Bacteriológica de água
Foi utilizada a técnica descrita por Greenberg et al. (1992), para determinação de coliformes totais e identificação de Escherichia coli, e a técnica de contagem padrão em placas (Pour Plate) para a contagem de bactérias mesófilas, presentes na água. Como referência da qualidade da água foi utilizada a portaria n0 1.469, de 29 de dezembro de 2000 do Ministério da Saúde.
2.6. Investigação Epidemiológica e Análise dos Dados
Para a investigação epidemiológica foi utilizado um questionário, padronizado para investigação de leptospirose, constando de identificação, animais presentes na propriedade, condições sanitárias da sala de ordenha e alojamento dos animais, presença de roedores próxima à criação de animais e domicílio. Para a análise dos resultados obtidos foi construído um banco de dados no programa EPI Info, constando das variáveis presentes no questionário de investigação.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO
O soro humano foi testado na MAT e apresentou título de 200 para o sorovar CCZ 380, 100 para o sorovar CCZ 206 e 50 para o sorovar CCZ 463 espécie genômica L. interrogans, e 100 para sorovar saprófita. Entre os sorovares reagentes na MAT destaca-se o sorovar CCZ 380, de espécie genômica ainda não identificada e o sorovar CCZ 206, espécie genômica L.noguchii (Jouglard et al., 2005), ambos isolados de pacientes humanos com leptospirose.
As manifestações clínicas relatadas pelo médico solicitante foram anorexia, calafrios, diarréia, dor abdominal, dor de cabeça intensa, dor de garganta, dor lombar, dor na coluna, dor na panturrilha, dores articulares, fadiga, cansaço, febre alta, icterícia, mialgias, náuseas, rigidez na nuca, rush cutâneo, síndrome gripal, sonolência, sudorese, sufusão conjuntival, tonturas, tosse e urina escura. O paciente relatou ter tido contato com roedores, animais em ordenha e com feto e restos fetais durante o parto do animal. A investigação epidemiológica na propriedade do paciente identificou fatores de risco descritos para a leptospirose, como o contato com roedores e animais portadores de leptospiras (Brod, et al., 2005, Faine et al.,1999, Levett, 2001).
A investiação identificou 7 animais bovinos de raça leiteira; 3 da raça canina e um eqüino. Os bovinos eram 2 machos, um castrado e um terneiro macho não castrado, e 4 fêmeas, 3 em lactação. Uma das fêmeas, segundo o tratador, apresentou retorno ao cio por três vezes. O soro de 3 fêmeas e 1 macho foram reagentes na MAT com títulos que variaram de 100 a 800, para os sorovares castellonis, ballum, pomona cepa proechimys e sorogrupo canícola sorovar CCZ 463 (figura 1). 

Figura 1- Sorovares identificados nas amostras de soros bovinos através da MAT.

O sorovar hardjo, comum de ser encontrado na espécie bovina (Egan,1986, Langoni et al., 2000), não foi identificado na sorologia, sendo que entre os sorovares reagentes estão dois sorovares comuns de ocorrência em camundongos. Este resultado pode ser explicado pelo contato dos animais com esta espécie de roedor, presentes no local de alojamento noturno e ração na forma de farelo, sendo o mesmo ambiente utilizado para a ordenha dos animais. 
Os caninos, todos machos, apresentaram reação na MAT, com títulos que variaram de 100 a 800 para o sorogrupo canicola, sorovares canicola (cepa Hond Utrecht IV) CCZ 89, e sorovares castellonis, panama e ballum, sorovar reagente também na espécie bovina (Figura 2). O soro da espécie canina que apresentou os maiores títulos e maior número sorovares reagentes foi identificado como o único cão mantido livre na propriedade, tendo contato com maior número de fatores de risco associados à doença nesta espécie (Furtado et al, 1997). 
Foi identificada a presença de roedores no alojamento dos animais, no estoque de ração e nas proximidades da residência. A presença de roedores no local de alojamento e estoque de ração confirmou o reservatório de leptospirose no local investigado. 
Para o isolamento de Leptospira foram semeadas 10 amostras, incluindo urina bovina, sangue canino e rins de roedores capturados no local de ordenha e depósito de ração. Destas amostras, 2 urinas bovinas e 1 de roedor apresentaram presença de espiroquetas, sendo que apenas da amostra roedor foi possível o cultivo enquanto as demais apresentaram contaminação por outras bactérias. A caracterização do novo isolado está em andamento, através de avaliação sorológica com soros do local do surto, produção de soro hiperimune e amplificação de genes por PCR.
A água analisada proveniente de um poço artesiano, apresentou 2,9 x 105 UFC/mL de bactérias mesófilas, 46.000 e 210 coliformes totais e Escherichia coli em 100 mL, e não se enquadrava nos padrões recomendados pelo Ministério da Saúde para o consumo humano e animal em criação intensiva, sendo o limite de UFC na contagem padrão ou total em placas de 5,0 x 102 UFC, e não aceitável a presença de coliformes fecais. Este indicador sugere a possibilidade da manutenção de leptospiras na água utilizada na propriedade, já que estas bactérias podem manter-se viáveis por meses (Faine et al., 1999).

Figura 2- Sorovares identificados nas amostras de soros caninos através da MAT.

4. CONCLUSÕES
A investigação epidemiológica realizada identificou as fontes de infecção e vias de transmissão para o paciente humano, e a contaminação ambiental na propriedade rural, tendo sido recomendada intervenção imediata através do tratamento dos animais, retirada de entulhos e alimento disponíveis para os roedores e aplicação de raticida. 

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALMEIDA, L.P.; MARTINS, L.F.S.; BROD, C.S.; GERMANO, P.M. Seroepidemiologic survey of leptospirosis among environmental sanitation workers in an urban locality in the southern of Brazil. Revista de Saúde Pública, 1994, 1, p. 76-81. 
BROD, C. S., ALEIXO, J. A., JOUGLARD, S. D., FERNANDES, C. P. H., TEIXEIRA, J. L.; DELLAGOSTIN, O. A.. Evidence of dog as a reservoir for human leptospirosis: a serovar isolation, molecular characterization and its use in a serological survey. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical , 2005, 38, p. 294-300.
EGAN, J. Leptospira interrogans serovar hardjo in the Republic of Ireland. In: W.A. ELLIS and T.W.A. LITTLE (ed.): Present state of leptospirosis diagnosis and control. Martinus Nijhoff, Dordrecht, The Netherlands, 211p., 1986.
FAINE, S.; ADLER, B.; BOLIN, C.; PEROLAT, P. Leptospira and Leptospirosis, p. -296. MediSci, Melbourne, Austrália, 1999.
FURTADO, L.R.I., ÁVILA, M.O., FEHLBERG, M.F.B., TEIXEIRA, M.M., ROSADO, R.L.I., MARTINS, L.F.S., et al. Prevalência e avaliação de fatores de risco à leptospirose canina no Município de Pelotas-RS. Arquivos do Instituto Biológico, 1997, 64, p. 57-61.
GREENBERG, A.E.; CLESCERI, L.S.; EATON, A.D. Standard Methods for examination of water and wash water. Washington, D.C.: American Public Health, 1991, 81, p. 1310-1312.
JOUGLARD, S.D.D. Diagnóstico de leptospirose por PCR e caracterização de isolados de Leptospira spp. por seqüenciamento do 16S rDNA e análise de VNTR. Tese (Doutorado) – 71f. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2005. 
LANGONI, H.; MEIRELES, L.R.; GOTTSCHALK, S. Perfil sorológico da leptospirose bovina em regiões do Estado de São Paulo. Arquivos do Instituto Biológico, 2000, 67, 37-41.
LEVETT, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Review, 2001, 14, p. 296-326.