AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOPROTETOR DE PROTEÍNAS DE ROTAS DE SECREÇÃO, UTILIZADAS COMO VACINA DE SUBUNIDADE CONTRA Leptospira spp.

CERQUEIRA, Gustavo Maia1; SILVA, Éverton Fagonde1; SEIXAS, Fabiana Kommling1; RIBEIRO, Samuel1; DELLAGOSTIN, Odir Antônio1

1Laboratório de Biologia Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. gcenbiot@ufpel.edu.br 

1. INTRODUÇÃO

Leptospira é um gênero clinicamente importante dentro do grupo das espiroquetas por ser o agente causador da leptospirose. Esta doença é uma das zoonoses mais dispersas no mundo (Who, 2003). Leptospira spp. tem um vasto repertório de adesinas e lipoproteínas, as quais vêm sendo testadas para o desenvolvimento de uma vacina contra leptospirose (Pallaniapan et al, 2006). Outros elementos também foram vistos contribuindo para a virulência desta espiroqueta como o flagelo periplasmático; hemolisinas e o próprio LPS (Faine et al, 1999). 
Vacinas do tipo bacterinas estão disponíveis, porém, apresentam imunidade pouco duradoura e são sorovar-específicas, o que as torna pouco eficazes no controle da enfermidade, uma vez que o gênero Leptospira apresenta mais de 250 sorovares (Faine et al 1999). Dentre as proteínas avaliadas quanto ao seu potencial protetor, a lipoproteína LipL32 e uma suposta adesina, pertencente ao grupo da Leptospiral Immunglobulin-like (Lig) mostraram ser candidatos promissores para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade contra a leptospirose (Branger et al, 2001; Palaniappan et al, 2006 e SILVA et al – comunicação pessoal). Porém, até o momento, LipL32 apresentou uma baixa proteção como vacina de subunidade (SEIXAS et al – comunicação pessoal) e as proteínas LigA e LigB parecem ter sua aplicação limitada em função da ausência e moderada conservação entre as espécies, respectivamente (Cerqueira, 2006). 
Este estudo busca avaliar o potencial protetor de proteínas componentes dos sistemas de secreção dos tipos II, III e ABC. Estes antígenos são consideradas bons alvos para vacina por estarem relacionadas com a expressão das lipoproteínas de superfície, secreção de fatores de virulência e transporte iônico para dentro e fora da célula bacteriana. Análises in silico demonstram as vantagens de se usar antígenos desta natureza frente a outros já mencionados, como por exemplo: (i) alta conservação de seqüência; (ii) ocorrência em todas as espécies de Leptospira e (iii) facilidade de expressão. O presente estudo busca avaliar o potencial de proteínas presentes nas diferentes rotas de secreção que transportam estas adesinas e lipoproteínas nas leptospiras, de forma a prevenir o estabelecimento da patogênese por meio de uma vacina multivalente.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Identificação in silico de proteínas candidatas ao estudo
As regiões codificadoras de proteínas pertencentes às diferentes rotas de secreção e transporte foram obtidas a partir da seqüência genômica de L. interrogans Copenhageni Fiocruz L1-130 depositada no GenBank e foram traduzidas in silico mediante o uso do software Vector NTi 10.0 (Invitrogen). As proteínas por elas codificadas foram analisadas quanto a hidrofobicidade e antigenicidade para que racionalmente fossem selecionados apenas as porções da proteínas que comportassem as melhores características de cada alvo. Uma vez selecionada a seqüência de aminoácidos mais apropriada de cada proteína foi feita a tradução reversa para a seqüência de nucleotídeos a fim de permitir o posterior desenho dos primers.
Desenho de primers e amplificação por PCR
Primers foram desenhados e analisados por meio do programa Vector NTI10.0. As regiões codificadoras foram amplificadas por PCR segundo o programa 94C por 3 min, 35 ciclos de 94C por 30 s, 55C por 30 s e 72C por 90 s e uma extensão final de 72C por 7 min. DNA genômico de L. interrogans Canicola Kito foi usado nas amplificações. Os produtos amplificados foram avaliados por eletroforese em gel de agarose 1%.
Clonagem e expressão de proteínas
As extremidades das regiões codificadoras amplificadas foram digeridas pelas enzimas de restrição BamHI e HindIII e foram ligadas às extremidades compatíveis no vetor pAE. Após a clonagem, o vetor foi introduzido por eletroporação na cepa de E. coli BL21 DE3 pLysS. As proteínas recombinantes foram expressas mediante a indução com 0,18 mM IPTG por 4 h. A expressão de cada proteína foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida 15%. As expressões bem sucedidas foram repetidas em um volume de 500 ml para fins de purificação.
Purificação, diálise e quantificação das proteínas
As proteínas foram purificadas por coluna de afinidade contendo níquel e em seguida foram dialisadas para a retirada da uréia, a qual foi necessária para a solubilização das proteínas recombinantes insolúveis. A diálise foi feita de forma lenta para permitir o redobramento nativo de cada proteína. As proteínas foram concentradas com 20% PEG e quantificadas pelo método de Bradford 
Análise de antigenicidade
Eletroforese em gel de poliacrilamida 15% foi realizada usando diferentes concentrações de cada proteína e então foram subseqüentemente transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Hybond – GE Healthcare). A membrana foi bloqueada com 5% leite em pó desnatado em 1XPBS e incubada por 1 hora com o soro diluído em 1XPBS (1:50). A membrana foi subseqüentemente incubada com anticorpo monoclonal anti-IgG humano conjugado com peroxidase, diluído em 1XPBS (1:50) (Calbiochem). A membrana foi então incubada com substrato cromógeno para constatação do aparecimento das bandas. O soro utilizado foi obtido do Laboratório de Patologia e Biologia Molecular do centro de Pesquisas Gonçalo Moniz – FIOCRUZ/BA.
Determinação da dose letal (DL50) em modelo animal
Para a padronização da dose de desafio, um experimento foi realizado. Grupos de 6 hamsters Golden syrian (3 machos e 3 fêmeas) foram inoculados com doses que variaram de 102 a 100 leptospiras. O cálculo da DL50 foi realizado segundo Faine et al, 1999.
Imunização dos animais e desafio homólogo
Grupos de 6 animais com 4 semanas de idade foram vacinados com duas doses de proteína recombinante (80 e 40 μg respectivamente) em intervalos de 14 dias, utilizando Freund como adjuvante. As proteínas foram inoculadas separadamente para avaliação de seu potencial individual. Dois grupos de animais controle foram incluídos os quais foram respectivamente vacinados com o adjuvante de Freund apenas (6 animais) e bacterina (3 animais). O desafio foi realizado inoculando-se aproximadamente 5 vezes o resultado da DL50%, 14 dias após a segunda dose das vacinas.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Identificação e expressão de alvos dos sistemas de secreção II, III e ABC
Dentre as proteínas analisadas por bioinformática 15 foram selecionadas para amplificação e clonagem (Tabela 1). 
Tabela 1 - Alvos para uso no desenvolvimento da vacina	
 	 	 	 	 	 	 	
Alvo	Peso da proteína recombinante (kDa)	Posição   celular*	Antigenicidade (Max.)	Hidrofobicidade (Max)	Processo celular	Conservação       entre sorovares (aminoácidos)	
LIC13383	14,7	Sup	0,78	1,34	Permease ABC	100%	
LIC12954	13,23	Sup	0,77	1,84	Permease ABC	99%	
Smc	68,22	Sup	0,94	0,48	Receptor externo	99%	
GspD	28,39	Sup	0,82	0,97	Rota secreção	100%	
GspE	44,56	Sup	0,75	0,87	Rota secreção	100%	
GspF	19,6	Sup	0,93	0,75	Rota secreção	100%	
GspG	14,75	Sup	0,73	0,04	Rota secreção	100%	
LolE	27,83	Sup	0,92	0,67	Exportação lipoproteínas	99%	
LolA	25,79	Sup	0,82	0,52	Carreador lipoproteínas	100%	
SecD	24,89	Sup	0,82	0,34	Exportação lipoproteínas	99%	
SecF	14,73	Sup	1,14	0,97	Exportação lipoproteínas	100%	
LolD	16,73	Cit	1,01	1,24	Transporte ABC	100%	
LIC11220	46,54	Sup	0,9	0,96	Transporte ABC	100%	
FliL	48,87	Cit	0,81	1,05	Secreção SSIII	100%	
EtpK	36,04	Cit	0,69	0,87	Secreção SSII	99%	
*Cit – Proteína citoplasmática, Sup – Proteína de superfície			

A localização das proteínas mencionadas na tabela 1, na célula bacteriana, não foi considerada como fator limitante uma vez que nosso objetivo era comparar o potencial entre alvos citoplasmáticos e de superfície juntos ou separadamente. Além disso, procurou-se privilegiar racionalmente regiões que maximizassem a expressão da proteína recombinante e mantivessem as características de antigenicidade apresentadas na análise in silico. Todos os 15 alvos selecionados foram amplificados e desses 10 foram clonados e expressos. Cinco dentre as proteínas recombinantes obtidas foram purificadas em grande quantidade para posterior avaliação (Lola, LolD, GspD, GspF e LIC1120) (Figura 1A).

Análise de antigenicidade
As proteínas recombinantes foram posteriormente analisadas com relação ao seu reconhecimento por anticorpos presentes no soro de humano com leptospirose em fase crônica. Diversos soros com títulos altos para Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, cepa Fiocruz L1-130, foram misturados e empregados na análise por Western blot. Dentre as 5 proteínas avaliadas apenas uma foi reconhecida por anticorpos presentes no soro (GspD) (Figura 1B). Acredita-se que aquelas que não foram reconhecidas possivelmente não estejam na conformação nativa ou ainda estimulem pouca ou nenhuma produção de anticorpos durante o curso da doença. Para esse fim, outros soros serão testados.

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   A						          B

Figura 1 – A – Eletroforese em gel de poliacrilamida demonstrando a presença das proteínas a serem testadas na elaboração da vacina. B – Teste de antigenicidade das proteínas recombinantes frente ao soro humano de paciente com leptospirose. 1 – LipL32, 2 – LolA, 3 – LolD, 4 – GspD, 5 – GspF e 6 – LIC11220.
Ensaio de imunoproteção
A padronização dos ensaios de DL50% revelou um resultado de 42 leptospiras. Dentre as proteínas avaliadas pelo teste de antigenicidade, duas foram analisadas quanto a imunoproteção (GspD e LolD). O grupo de animais vacinado com a proteína GspD apresentou taxa de sobrevivência de 16,66% (1 animal sobrevivente). No vacinado com a proteína LolD, assim como no grupo controle inoculado apenas com o adjuvante, nenhum animal sobreviveu. Acredita-se que a proteção induzida pela proteína GspD possa ser melhorada em experimentos futuros onde será avaliado (i) uma vacina composta por proteínas de diferentes rotas de secreção; (ii) diferentes concentrações de antígenos e (iii) menor número de leptospiras utilizada no desafio.
 
4. CONCLUSÕES
Dentre as 15 proteínas selecionadas, 5 foram inicialmente produzidas recombinantes e purificadas para serem usadas neste estudo. Destas, a proteína LolD não conferiu proteção frente ao desafio. A proteína GspD apresentou uma baixa proteção nas condições em que o teste foi realizado. As demais proteínas selecionadas serão também avaliadas em experimentos futuros. 

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Branger, C., Sonrier, C., Chatrenet, B., Klonjkowski, B., Ruvoen-Clouet, N., Aubert, A. Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination. Infection and Immunity, 2001, 69, 6831-6838.
Cerqueira, G.M. Caracterização de Leptospira spp. quanto à presença e conservação dos genes da família lig: alvos potenciais para utilização em vacina e testes de diagnóstico. Pelotas, 2006, 52 p. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Agrícola, Universidade Federal de Pelotas, 2006.
Faine, S.B., Adler, B., Bolin, C., Perolat, P. Leptospira and leptospirosis. 2nd ed. Melbourne, Australia: MediSci, 1999.
Palaniappan, R.U., McDonough, S.P., Divers, J., Chen, C.S., Pan, M.J., Matsumoto, M. and Chang, Y.F. Immunoprotection of recombinant leptospiral immunoglobulin-like protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection. Infection and Immunity, 2006, 74,1745-1750.
WHO. Leptospirosis worldwide. Weekly Epidemiology Records. 1999, 74, 237-242.