EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DO ORIGANUM VULGARE FRENTE A LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA 
 
SANTIN, Rosema1; CLEFF, Marlete Brum4; FONSECA, Anelise Oliveira da Silva2; MEINERZ, Ana Raquel4; MADRID, Isabel2; FARIA, Renata Osório2; NASCENTE, Patrícia4; RODRIGUES, Maria Regina3; MEIRELES,Mário Carlos de Araújo2

1Bolsista CNPq, Faculdade Veterinária, UFPel. seminhavet@yahoo.com; 2Departamento de Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária, UFPel. meireles@ufpel.tche.br; 3Departamento de Química Orgânica, UFPel;  4Programa de pós-graduação em Ciências Veterinária, Fac.Veterinária, UFRGS.

1.	INTRODUÇÃO

Cerca de 80% da população mundial utiliza plantas medicinais como terapia, sendo que mais de 365.000 espécies de plantas já foram catalogadas. Uma das plantas muito utilizada como tempero na culinária brasileira é o orégano, que pertence à família Lamiaceae. A subespécie Origanum vulgare é a mais estudada, especialmente em relação à composição e qualidade de seu óleo essencial, muito utilizado como tônico na medicina popular. Suas flores e folhas são usadas extensivamente pela homeopatia e o óleo vem sendo utilizado na tradicional medicina indiana com diversos fins, principalmente devido à ação antibacteriana, antifúngica e antioxidante, propriedades estas atribuídas aos seus componentes químicos (Dorman et al., 2000; Vichi et al., 2001; Baydarh et al., 2004; Busatta, 2006). 
A crescente importância clínica atribuída às doenças fúngicas, principalmente em indivíduos imunodeprimidos tem impulsionado pesquisas para se obter produtos mais eficazes e menos tóxicos no tratamento das micoses (Arango et al., 2004; Catalan e& Montejo, 2006). A candidíase é uma micose decorrente da infecção por diferentes espécies de Candida. Em humanos esta micose oportunista é freqüente e, geralmente, o microrganismo encontra-se colonizando pele e mucosas como cavidade oral, vaginal e trato gastrointestinal, podendo causar infecções localizadas e/ou sistêmicas. Na espécie canina, as leveduras do gênero Candida têm sido isoladas, principalmente, do tegumento e mucosas (Lacaz et al.,1980; Raposo et al., 1996; Kano et al., 2001; MacEwan, 2001). 
Devido ao limitado espectro de ação dos antifúngicos disponíveis, assim como os freqüentes efeitos colaterais descritos, as pesquisas com substâncias oriundas de vegetais representam uma boa perspectiva. Assim, o objetivo deste trabalho foi de avaliar o efeito do óleo essencial do Origanum vulgare frente à Candida spp.

2. MATERIAL E MÉTODOS

A suscetibilidade de oito isolados de leveduras do gênero Candida foi estudada frente ao óleo essencial do orégano. Foram utilizadas cinco amostras de C. albicans, sendo três provenientes de fêmeas caninas e dois isolados padrões (ATCC), além de três espécies não-albicans (ATCC). 
O óleo essencial do O. vulgare foi extraído através da técnica de hidrodestilação em aparelho de Clevenger por quatro horas, sendo posteriormente seco em Na2 SO4 (anidro, grau p.a, Merck) e concentrado sob N2 (ultra puro, 99,99%, White Martins), obtendo-se um rendimento final de 1 mL  de óleo essencial. Depois de extraído, o óleo foi submetido à análise cromatográfica em um equipamento GC/FID (Schimadzu-17 A) equipado com uma coluna de sílica DB-5 (30m x  0,25mm x 0,25um), nas seguintes condições cromatográficas: 40ºC – 2ºC/min; 145ºC –10ºC/min; 280ºC - 10 min; Td = 280ºC; Tinj = 280ºC; T col = 40ºC; split = 1:50. Posteriormente foi preparada uma solução de óleo a 5000ppm em hexano, e uma solução de 40 ppm dos padrões, que foram injetadas no cromatógrafo e comparadas em relação aos tempos de retenção na coluna cromatográfica.
O estudo da suscetibilidade ao óleo essencial foi realizado através da técnica de microdiluição em caldo conforme os documentos NCCLS/M-27A adaptados para um fitofármaco. O inóculo de Candida foi preparado a partir de uma suspensão de colônias jovens da levedura em solução salina estéril, com a posterior homogeneização em agitador vortex e ajustado a turbidez em 0,5 da escala de MacFarland que é equivalente a 1 - 5 x 106 UFC/mL. Uma alíquota de 100µL da suspensão fúngica foi colocada em um tubo contendo 100uL de solução salina estéril e após homogeneização foram retiradas 500µL dessa solução para um tubo com 9,5 mL de RPMI líquido, obtendo-se assim o inoculo fúngico a ser testado frente as diluições do óleo. 
Para a avaliação da CIM (Concentração Inibitória Mínima), foram utilizadas 10 diluições, em RPMI 1640, do óleo essencial entre as concentrações de 1 a 0,0020% para testar a suscetibilidade frente a Candida, as quais foram dispostas em microplacas em mesmo volume que o inoculo, sendo que todos os testes foram feitos em triplicata. As placas foram incubadas a 35ºC por 48 horas e a interpretação dos resultados foi realizada através da visualização da turvação referente à multiplicação do microrganismo, comparada aos controles positivos e negativos, sendo a menor concentração capaz de produzir proeminente inibição do crescimento da levedura, em relação a cavidade controle positivo, aquela identificada como a CIM do óleo essencial para o agente fúngico estudado.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após 48 hs as placas de microdiluição foram observadas, demonstrando que os isolados de C. albicans, obtidos de fêmeas caninas, apresentaram-se resistentes ao óleo essencial do O. vulgare nas concentrações testadas, as cepas padrões foram inibidas em uma concentração do óleo que variou 1 a 0,5 %, enquanto que os isolados das espécies não-albicans foram inibidos em uma concentração inibitória mínima (CIM) de 1 a 0,25% (FIG.1). Diversos estudos têm demonstrado a potencialidade antimicrobiana do Origanum vulgare, com diferentes técnicas adaptadas de antifungigrama como técnica de difusão em ágar, difusão em disco e a técnica de diluição em caldo, sendo que o uso da técnica de microdiluição tem sido utilizado com bons resultados (Lambert et al., 2001; Arango et al., 2004; Baydarh et al., 2004; Busatta, 2006).

 (-)        (1%)      (0,5%)    (0,25%) 

A

B

C

FIG.1 – Placa de microdiluição a leitura da CIM dos isolados padrões de Candida albicans (B,C) e Candida não-albicans (A) em 48 Hs.

Em relação as CIMs foi observada homogeneidade dos valores entre os isolados padrões analisados, diferente do que ocorre quando usam -se substâncias antifúngicas puras. Esta homogeneidade, provavelmente ocorre pela diversificada composição química do óleo essencial que dificulta a utilização pelo microrganismo de rotas metabólicas alternativas (Mastelic & Jerkovic, 2000; Arango et al., 2004; Baydarh et al., 2004).
Na análise cromatográfica da amostra de orégano utilizado, verificou-se como componentes majoritários o 4-terpineol, gama-terpineno, timol e carvacrol, sendo que os dois últimos compostos fenólicos apresentaram-se em baixas concentrações quando comparados aos outros constituintes do óleo, porém com maior concentração de timol em relação ao carvacrol, estes resultados podem ter sido responsáveis pela resistência dos isolados de campo frente a este óleo essencial, já que a atividade antifúngica destes extrato têm sido atribuída aos dois compostos fenólicos (Lambert et al., 2001; Bussata, 2006). A composição do óleo essencial da planta pode variar conforme os fatores geográficos e época da colheita, assim como a quantidade do óleo presente em cada espécie, sendo descrito diferenças morfológicas e rendimentos diferenciados quanto aos teores do óleo essencial. Dessa forma a altitude, as condições climáticas, o cultivo, as condições de secagem e estocagem entre outras, influenciam na composição, qualidade e quantidade de óleo essencial das plantas (Kokkini et al., 1994; Mastelic & Jerkovic, 2000; Dorman et al., 2000; Arango et al., 2004).

4.	CONCLUSÕES

Os resultados demonstram que as diferenças entre os isolados de campo e as cepas padrões, assim como as baixas concentrações de timol e carvacrol parecem ter uma influência na atividade antifúngica do óleo. Tendo em vistas estes resultados, são necessários mais estudos envolvendo outros óleos com diferente composição química, incluindo a comparação destes com padrões comerciais.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARANGO, A.C.M.; SÁNCHEZ, J.G.B.; GALVIS, L.A.B. Productos naturales con actividad antimicótica. Rev. Esp. Quimioterapy. v.17, p. 325-331, 2004. 
BAYDARH.; SAGDIÇ, O.; OZKAN, G. Antibacterial activity and composition of essential oils from Origanum, Thymbra and Satureja species with commercial importance in Turkey. Food Control, v. 15, p. 169-172, 2004.
BUSATTA, C. Caracterização química e atividade antimicrobiana in vitro e em alimentos dos extratos de orégano e manjerona. Erechim - RS. 94 p. Dissetração (Mestrado em Engenharia de Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões (URI), Erechim - RS, 2006.
CATALÁN, M. & MONTEJO, J.C. Antifúngicos sistémicos. Farmacodinamia y Farmacocinética. Rev. Iberoam. Micol., v.23, p.39-49, 2006.
DORMAN, H.J.D.; SURAI, P.; DEANS, S.G. In vitro antioxidant activity of a number of plant essential oils and phytoconstituents. J Essenc Oil Res, v.12, p.241, 2000. 
KANO, R.; HATTORI, Y.; OKUZUMI, K.; MIYAZAKI, Y.; YAMAUCHI, R.; KOIE, H.; WATARI, T.; HASEGAWA, A. Detection and identification of Candida species by 25S ribossomal DNA analysis in the urine candidal cystitis. J Vet Med Sc, v. 64, n. 2, p. 115-117, 2001.
KOKKINI, S.; KAROUSOU, R.; VOKOU, D.; Pattern of geographic variation of Origanum vulgare trichomes and essential oil content in Greece. Bioch System Ecol. v.22, p.517-528, 1994.
LACAZ, C. S.; PETTINATI, A .S.; SALEBIAN, A.  Candidíases. São Paulo: Ed. da Universidade de São Paulo, 1980, 190p.
LAMBERT, R.J.W.; SKANDAMIS, P.N.; COOTE, P.J. A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano esssencial oil, thymol and carvacrol. J Appl Microb, v.91, p.453-462, 2001 
McEWAN, N. A. Malassezia and Candida infections in bull terriers with lethal acrodermatitis. J Small Anim Pract, v. 42, p. 291-297, 2001.
MASTELIC, J.; JERKOVIC, I. Chemicalncomposition and antioxidant effect of glycosidically bound volatile compounds from oregano (Origanum vulgare L. spp. hirtum). Food Chemistry, v.71, p.79, 2000.
RAPOSO, J.  B.; NOBRE, M. O.; FERNANDES, C. G.; PORTO, M. Candidíase cutânea em um canino. Rev Fac Zoot Vet Agron. Uruguaiana, v. 2/3, n. 1, p. 11-14, 1996. 
RHYU, H.Y. Gas chromatographic characterization of oregano and other selected spices of the labiate family. J Food Sc, v.44, p.1373-1378, 1979.
VICHI, S.; ZITTERL-EGLSEER, K.; JUGI, M.; FRANZ, C. Determination of the presence of antioxidants deriving from sage and oregano extracts added to animal fat by means of assessment of the radical scavenging capacity by photochemiluminescence analysis. Nahrung-Food, 45(2), p.101-104, 2001.