PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DOS GENES DAS ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS A, B, C e D DE Staphylococcus aureus ISOLADOS DE ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL

ZOCCHE, Fernando1*, FRANÇA, Rodrigo Correa2, SILVA, Wladimir Padilha3

1 – Doutorando em Ciência e Tecnologia Agroindustrial – PPGCTA – FAEM – UFPel
2 – Aluno de Medicina Veterinária – Bolsista de Iniciação Científica da FAPERGS
3 – Professor Doutor – PPGCTA – FAEM – UFPel
1,2,3 Laboratório de Microbiologia de Alimentos – MICROBIAL - * zocche@ufpel.edu.br

1.	INTRODUÇÃO

Entre as bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus, S. aureus é a espécie mais envolvida com intoxicação alimentar estafilocócica e, por muitos anos, foi a única relacionada com produção de enterotoxinas estafilocócicas (EE), as quais são proteínas tóxicas que, quando ingeridas com o alimento, podem provocar doença. Os sintomas clássicos da intoxicação estafilocócica são náuseas, vômitos, câimbras abdominais, diarréia, dores de cabeça, sudorese e prostração, que aparecem, em média, cerca de 4 horas após a ingestão dos alimentos e que possuem duração de 24 a 48 horas.
Staphylococcus aureus pode produzir uma ou mais EE simultaneamente (Silva et al., 2005) e, apesar deste patógeno ser produtor de uma grande variedade de EE, 95% dos surtos são causados por enterotoxina estafilocócica A (EEA), EEB, EEC, EED e EEE (Letertre et al., 2003).
Técnicas baseadas na manipulação do material genético são alternativas para a detecção e identificação de bactérias patogênicas oriundas de alimentos. Uma das mais utilizadas é o PCR multiplex (mPCR), a qual utiliza mais de um par de primers na mesma reação, permitindo a detecção de mais de um gene e/ou mais de uma bactéria simultaneamente. Esta técnica é mais sensível, específica e rápida que as técnicas tradicionais comumente utilizadas na pesquisa de S. aureus (Nájera-Sanchez et al., 2003).
Considerando a grande aplicabilidade do mPCR, e a importância da determinação do tipo de EE como fator relevante na avaliação epidemiológica de casos e surtos de intoxicação estafilocócica, objetivou-se avaliar duas reações mPCR para a detecção de genes de EE de S. aureus isolados de alimentos de origem animal.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 20 isolados de Staphylococcus aureus oriundos de alimentos de origem animal, identificados através da produção da coagulase, β-galactosidase e catalase, coloração por Gram e resistência à acriflavina, conforme descrito por Lancette & Benett (2001) e Gandra et al. (2003).
A extração de DNA genômico dos isolados de S. aureus foi realizada de acordo com o protocolo proposto por Matthews et al. (1997). Para a reação mPCR foram preparados 2 conjuntos. Para o primeiro conjunto, foram utilizados 1µL do DNA extraído (10 a 20ng. µL-1), 2,5µM de dNTP mix, 1U de Taq DNA polimerase, 50mM de MgCl2, água ultra pura esterilizada (qsp) e tampão 10X para PCR, 10µM de cada conjunto de primers ESA1 e 2, ESB1 e 2, femA1 e A2, descritos na Tabela 1, perfazendo um total de 40µL por reação. Para o segundo conjunto foram utilizadas as mesmas concentrações e volumes dos reagentes do primeiro conjunto, com exceção dos primers ESA1 e 2 e ESB1 e 2, que foram substituídos pelos primers SEC1 e 2 e SED1 e 2, descritos na Tabela 1. Os dois conjuntos foram submetidos a 95ºC por 5 minutos e, posteriormente, termociclados por 37 ciclos, onde cada ciclo consistia de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 44,5ºC, e 1 minuto a 72ºC, finalizando com uma extensão à 72ºC por 10 minutos.

Tabela 1: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a identificação de S. aureus enterotoxigênicos e respectivos produtos de amplificação
Primers	Seqüência 5’  3’	Posição no gene	Produto de amplificação (pb1)	
ESA1*	ACG ATC AAT TTT TAC AGC	203 a 222	544	
ESA2*	TGC ATG TTT TCA GAG TTA ATC	726 a 746		
ESB1*	GAA TGA TAT TAA TTC GCA TC	621 a 640	416	
ESB2*	TCT TTG TCG TAA GAT AAA CTT C	1015 a 1036		
SEC1**	GAC ATA AAA GCT AGG AAT TT	676 a 695	257	
SEC2**	AAA TCG GAT TAA CAT TAT CCA	912 a 932		
SED1	CAA ATA TAT TGA TAT AAT GA	4 a 23	330	
SED2	AGT AAA AAA GAG TAA TGC AA	314 a 333		
femA1a	AAA AAA GCA CAT AAC AAG CG	1444 a 1463	132	
femA2a	GAT AAA GAA GAA ACC AGC AG	1556 a 1575		
Fonte: * Rosec e Gigaud (2002); **Nájera-Sanchez et al. (2003); 1 pares de base; aMehrotra et al. (2000).

Em todas as reações mPCR foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores femA1 e femA2 para a amplificação do gene femA, um gene espécie-específico que codifica para uma proteína envolvida na resistência do microrganismo à meticilina e que está presente universalmente em S. aureus. Os primers femA1 e femA2 foram adicionados em todas as reações, conferindo um controle interno (IAC) não competitivo à reação (Hoorfar et al., 2004), minimizando as possibilidades de resultados falso negativos. Como controles positivos, foram utilizados DNAs de cepas padrão de Staphylococcus aureus FRIS6 (produtor de enterotoxinas A e B) e Staphylococcus aureus FRI361 (produtor de enterotoxinas C e D).

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os fragmentos dos genes de EEA, EEB e FemA foram corretamente amplificados no mPCR através do primeiro conjunto de reação, o mesmo ocorrendo no segundo conjunto, onde os fragmentos dos genes de EEC, EED e FemA, também foram amplificados. Os produtos da amplificação destes fragmentos podem ser observados na Figura 1.

1     2      3     4     5

100 pb

femA (132 pb)

sec (257 pb)

sed (330 pb)

sea (544 pb)

seb (416 pb)

Figura 1: produtos de PCR visualizados em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídeo. Pistas 1 e 2: amplificações simultâneas obtidas com os primers ESA1 e 2, ESB1 e 2, femA1 e 2 e DNA de S. aureus FRI S6; Pistas 3 e 4: amplificações simultâneas obtidas com os primers SEC1 e 2, SED1 e 2, femA1 e 2 e DNA de S. aureus FRI 361; 5: marcador de massa molecular 100 pb.

Após a padronização das reações mPCR, 20 isolados de S. aureus foram avaliados quanto à presença de genes de enterotoxinas. Do total analisado (n=20), foi possível amplificar o gene femA em 100% dos isolados, permitindo uma correta identificação do microrganismo, no entanto, apenas 6 isolados (30%) albergavam um ou mais genes de enterotoxinas simultaneamente. Os resultados do mPCR podem ser observados na Tabela 2.

Tabela 2: Presença de genes de EE em S. aureus isolados de alimentos
Isolado	mPCR para detecção do genea	
	sea	seb	sec	Sed	femA	
R15	-	+	-	-	+	
R19	+	+	-	-	+	
R24	-	+	-	-	+	
R25	-	+	-	-	+	
R27	-	-	-	+	+	
R29	-	-	-	+	+	
a Reação positiva (+) indicada através de amplificação específica do fragmento do gene.

Diversos estudos foram conduzidos através de PCR multiplex para a detecção de cepas enterotoxigênicas de Staphylococcus aureus, na tentativa de estabelecer possíveis fontes de contaminação dos alimentos. Sharma et al. (2000) e Nájera-Sanchez et al. (2003), observaram presença simultânea dos genes sea e seb em reação mPCR, resultado semelhante ao encontrado neste estudo, e relacionaram a presença destes genes com S. aureus de origem humana. Entretanto, ao contrário do desenvolvido neste estudo, esses autores não utilizaram um controle interno de reação, o que segundo Hoorfar et al. (2004), é imprescindível no desenvolvimento de técnicas moleculares de diagnóstico que envolvam PCR.
Nájera-Sanchez et al. (2003), trabalhando com S. aureus isolados de alimentos no México, desenvolveram duas reações mPCR para detecção dos genes de EEA, EEB, EEC, EED e EEE. Esses autores relacionaram a presença de S. aureus de origem bovina e suína com os genes sec e sed, respectivamente, e buscaram a detecção simultânea destes genes, o que também foi desenvolvido neste trabalho, e consideram que, quando vários pares de primers são utilizados simultaneamente, um ou mais fragmentos de genes podem não ser amplificados, prejudicando dessa forma, a reação.
Silva et al. (2005) também desenvolveram com sucesso duas reações mPCR para detecção dos genes sea, seb e sec em S. aureus, utilizando o gene femA como controle interno da reação. Esses autores buscaram a detecção de sea e seb simultaneamente, no entanto, a avaliação da presença do gene sec não foi realizada na mesma reação, estratégia semelhante à adotada neste trabalho.

4.	CONCLUSÕES

Os dois conjuntos de mPCR propostos permitiram detectar genes de EEA, EEB, EEC, EED em Staphylococcus aureus isolados de alimentos de origem animal.

5.	AGRADECIMENTO
CNPq, processo no.478100/04-3.

6.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. GANDRA, E.A. Identificação de Staphylococcus aureus, S. intermedius e S. hyicus através de testes bioquímicos e da amplificação por PCR de seqüências dos genes coa e nuc. Dissertação de mestrado. 100p. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2003.
2. HOORFAR, J.; MALORNY,B.; ABDULMAWJOOD, A.; COOK, N.; WAGNER, M.; FACH, P. Practical Considerations in Design of Internal Amplification Controls for Diagnostic PCR Assays. Journal of Clinical Microbiology, V.42, p. 1863–1868, 2004.
3. LANCETTE, G. A.; BENETT, R.W. Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins In: Downes, F.P.; Ito, K. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4 Ed. Washington: American Public Health Association, 2001. p. 387-400.
4. LETERTRE, C.; PERELLE, S.; DILASSER, F.; FACH, P. Detection and genotyping by real-time PCR of the staphylococcal enterotoxin genes sea to sej. Molecular and Cellular Probes, v. 17, p. 139-147, 2003.
5. MATTHEWS, K. R.; ROBERSON, J.; GILLESPIE, B. E.; LUTHER, D. A.; OLIVER, S. P. Identification and differentiation of coagulase-negative Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. Journal of Food Protection, v.60, p.686-688. 1997.
6. MEHROTRA, M.; WANG, G.; JOHNSON, W.M. Multiplex PCR for Detection of Genes for Staphylococcus aureus Enterotoxins, Exfoliative Toxins, Toxic Shock Syndrome Toxin 1, and Methicillin Resistance. Journal of Clinical Microbiology, v. 38, p. 1032–1035. 2000.
7. NÁJERA-SANCHEZ, G.; MALDONADO-RODRÍGUEZ, R.; OLVERA, P. R.; GARZA, L. M. Development of two multiplex polymerase chain reactions for the detection of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus isolated from foods. Journal of Food Protection. v. 66, p. 1055-1062, 2003.
8. ROSEC, J. P.; GIGAUD, O. Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France. International Journal of Food Microbiology. v.77, p.61-70, 2002.
9. SHARMA, N.K.; REES, C.E.D.; DODD, C.E.R. Development of a single-reaction multiplex PCR toxin typing assay for Staphylococcus aureus strains. Applied and Environmental Microbiology, v.66, p.1347-1353. 2000.
10. SILVA, E. R.; CARMO, L. S.; SILVA, N. Detection of the enterotoxins A, B and C genes in Staphylococcus aureus from goat and bovine mastitis in Brazilian dairy herds. Veterinary Microbiology, v.106, p. 103-107, 2005.