VITAMINA C EM AMORA- PRETA: COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODO TITULOMÉTRICO E CROMATOGRÁFICO
PILECCO, Juliana Lima1; CHIM, Josiane Freitas2; ZAMBIAZI, Rui Carlos2.
1Deptº de Ciência dos Alimentos – Curso de Química de Alimentos/UFPel
2Deptº de Ciência e Tecnologia Agroindustrial – Programa de Pós-graduação/FAEM/UFPel
Campus Universitário  – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. josianechim@gmail.com

1.	INTRODUÇÃO

Vitamina C é a mais importante vitamina para a nutrição humana sendo suplementada através de frutas e vegetais (Hernandez et al.,2006). Vitamina C é o termo genérico de compostos que desempenham a atividade vitamínica, embora em diferentes níveis (Burdulu et al., 2006). O ácido L-ascórbico (AA) é a forma mais biologicamente ativa da vitamina C, podendo ser composta também pelo ácido dehidroascórbico (DHA), que representa a forma oxidada do ácido L-ascórbico, com cerca de 80% de atividade vitamínica, além do ácido Isoascórbico ou ácido eritoórbico, que apresenta 5% de atividade vitaminíca, porém são usados legalmente como aditivos antioxidantes em alimentos (Fontannaz et al., 2006; Valpuesta & Botella, 2004).
A amoreira-preta é uma frutífera de grande potencial para as regiões brasileiras, propícia para pequenas propriedades agrícolas e de elevado valor nutritivo (Antunes, 2002). Apresenta como características da forma in natura, alto conteúdo de água, 10% de carboidratos, elevado conteúdo de minerais, vitaminas B,A e cálcio(Antunes, 2002), contém ainda cerca de 20 mg/100g de vitamina C, quantidade relativamente baixa se comparada com outras pequenas frutas como framboesa (30mg/100g) e morango (80 mg/100g) (Agar et al., 1997).
A quantificação da vitamina C é dificultada pela instabilidade do composto, sendo que normalmente sua quantificação se dá através de agentes redutores (Fontannaz et al., 2006). Diversos métodos analíticos são reportados para a determinação de vitamina C, porém as maiorias dos métodos oficiais, somente estimam o conteúdo total de vitamina C, não fazendo a discriminação entre a espécies oxidadas do ácido L-ascórbico, como ácido dehidroascórbico (DHA) e isoascórbico (isoAA).(Fontannaz et al, 2006, Hernandez et al., 2006).
O presente trabalho teve por objetivo analisar quantitativamente o conteúdo de vitamina C em três cultivares de amora-preta através do método titulométrico e cromatográfico e comparar a perfomance de cada um.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

	Utilizaram-se frutas in natura de amora-preta, cultivares Brazos, Tupi e Guarani, cultivadas na região de Pelotas-RS e colhidas no período de novembro a dezembro de 2005, em campos experimentais da Embrapa Clima Temperado (Pelotas-RS), e mantidas sob congelamento, em embalagens de polietileno de baixa densidade até a chegada ao laboratório de análises físico-químicas (DCA – UFPel). 
	Foram realizadas análises de quantificação de vitamina C através do método titulométrico segundo a metodologia iodométrica de Lorenz-Steves (Winton & Winton, 1947), baseado na ação redutora do ácido ascórbico, fazendo uso de solução padrão de iodo e tiossulfato de sódio e solução de amido como indicador; e pela cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), segundo a metodologia descrita por Vinci et al., 1995. As análises cromatográficas foram desenvolvidas com o cromatógrafo líquido Shimadzu LC-10AT, equipado com sistema detector de UV em coluna de fase reversa (RP-18; 5µm; 4.6 x 250mm).  As análises foram realizadas nas condições cromatográficas de: 10µL de volume de injeção da amostras em fluxo de 0,8 mL/ min com detecção a 254 nm, tendo como fases móveis solução de ácido acético 0,1% em água ultra pura e metanol 100%, usando o ácido L-ascórbico como padrão.
	 Os resultados obtidos no estudo foram avaliados por análise de variância ANOVA, sendo aplicado posteriormente o teste de Tukey para comparar as médias de cada determinação, ao nível de 5% de probabilidade através do software Statistica 6.0.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados de quantificação de vitamina C pelo método titulométrico encontram-se na tabela 1.

Tabela 1. Conteúdo de vitamina C em cultivares de amora-preta por titulometria.

Cultivares	Vitamina C (mg/100g)*	
Brazos	9,69b	
Guarani	10,73b	
Tupi	15,17a	
*Resultados médios referentes a três determinações.
Letras diferentes representam diferença significativa ao nível de 5% de significância.

Os dados acima concordam a literatura de conteúdo total de vitamina C para amora-preta, porém este conteúdo varia de acordo com o tipo de cultivar, tipo de solo, forma de cultivo, condições climáticas, procedimentos agrícolas e condições de armazenamento (Agar et al., 1997; Bates, 1997; Burdulu, et al., 2005)  .

	Os resultados da quantificação de ácido L-ascórbico por HPLC encontram-se na tabela 2.

Tabela 2. Conteúdo de ácido L-ascórbico em cultivares de amora-preta via HPLC.

Cultivares	Ácido L-ascórbico (mg/100g)	
Brazos	0,71a	
Guarani	0,73a	
Tupi	2,4b	
Letras diferentes representam diferença significativa ao nível de 5% de significância.

	A figura 1 representa um cromatograma típico de determinação de vitamina C (ácido L-ascórbico).

Figura 1. Cromatograma típico de quantificação de vitamina C (ácido L-ascórbico) em amora-preta cultivar Tupi.

	Os resultados acima concordam com estudos desenvolvidos por Kafka et al., 2006, o qual comparou cultivares de amora-preta em relação ao conteúdo de ácido L-ascórbico e reportou cerca de 2,5 mg/100g ou não identificou este ácido em algumas cultivares. 
	Com base nos resultados obtidos por cromatografia podemos notar que houve uma redução significativa do conteúdo de vitamina C em comparação com o método titulométrico, isto se deve possivelmente ao fato de que pelo método titulométrico, a quantificação do conteúdo total de vitamina C se dá por base na oxidação do ácido L-ascórbico e portanto a leitura é feita com base nas formas oxidadas deste composto, não havendo a separação entre AA/DHA. No método cromatográfico quantifica-se isoladamente o ácido L-ascórbico e não vitamina C total, com base em uma curva de calibração feita com padrão de ácido L-ascórbico com pureza de 99,99% e portanto não há a quantificação de suas formas oxidadas. Por este método faz-se a leitura mais segura do constituinte de atividade biológica mais ativa da vitamina C.

4. CONCLUSÕES
	Através do estudo pode-se confirmar que a análise titulométrica não esboça a real quantidade de vitamina C biologicamente ativa (ácido L-ascórbico), fazendo-se a leitura também de suas formas oxidadas, representando o total de vitamina C. A determinação deste composto (ácido L-ascórbico) deve ser feita de forma que permita o isolamento de suas formas oxidadas, sendo o método cromatográfico mais eficiente nesta tarefa.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGAR, i.t.; STREIF, J.; BANGERTH, F. Effect of high CO2 and controlled atmosphere (CA) on the ascorbic and dehydroascorbic acid content of some berry fruits. Postharvest Biology and Technology, v. 11, p. 47-55, 1997.
ANTUNES, L. E. C. Amora-preta: nova opção de cultivo no Brasil. Ciência Rural, Santa Maria, v. 32, n. 1, p. 151-158, 2002.
BATES, C. J. Vitamin C: new appoaches to bioavailability and turnover. Nutrition & Food Science, n.6, p. 236-238, nov./dec.1997.
BURDURLU, H. S.; KOCA, N.; KARADENIZ, F. Degradation of vitamin C in citrus juice concentrates during storage. Journal of Food Engineering, v.74, n.2, p. 211-216, mai. 2006.
FONTANNAZ, P. ;KILINÇ, T.; HEUDI, O. HPLC-UV determination of total vitamin C in wide range of fotified food products. Food Chemistry, v.94, n.4, p.626-631, mar. 2006.
HERNÁNDEZ, Y.; LOBO, M. G.; GONZALÉZ, M. Determination of vitamin C in tropical fruits: A comparative evaluation of methods. Food Chemistry, v.96, p. 654-664, 2006.
KAFKAS, E.; KOSAR, M.; TÜREMIS, N.; BASER, K.H.C. Analysis of sugars, organic acids and vitamin C contents of blackberry genotypes from Turkey. Food Chemistry, v.97, p. 732-736, 2006.
VALPUESTA, V. and BOTELLA, M. A. Biosynthesis of L-ascorbic acid in plants: new pathways for an old antioxidant. TRENDS in Plant Science, v.9, n.12, p. 573-576, Dec. 2004.
VINCI, G.; ROT, F.; MELE,G. Ascorbic acid in fruits, a liquid chromatographic investigation. Food Chemistry, v. 53, p. 211-214, 1995.
WINTON, A.; WINTON, K.B. Analisis de Alimentos. Buenos Aires: Hispano Americano, 1947. 1199p.