REGIÕES GENÓMICAS ASSOCIADAS À GERMINAÇÃO/EMERGÊNCIA EM ARROZ IDENTIFICADAS MEDIANTE ESTUDOS DE ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES DO TIPO MICROSATÉLITE
FISS, Guilherme1; MALONE, Gaspar2; PESKE, Silmar Teichert3; ZIMMER, Paulo Dejalma3; VINHOLES, Patrícia da Silva1; AMARAL, Fernanda Plucani.1

1Bolsista Iniciação Cientifica PIBIC/CNPq, PPGC&TS, FAEM/UFPel, 2 Doutorando PPGC&TS, FAEM/UFPel, 3 Prof. Departamento de fitotecnia, FAEM/UFPel
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. guigofiss@ig.com.br

1.	INTRODUÇÃO

O desempenho produtivo do arroz e das demais espécies de importância agrícola depende muito do número de plantas por unidade de área, altamente correlacionado com o vigor das sementes. Tradicionalmente os programas de melhoramento genético não selecionaram de forma direta caracteres relacionados à qualidade de sementes, o que contribuiu para o desenvolvimento de constituições genéticas superiores para produção de grãos, mas algumas vezes deficientes na capacidade de germinação e emergência no solo, principalmente sob condições adversas. O arroz daninho é uma excelente fonte de variabilidade genética para o melhoramento do arroz, pois se constitui num acervo de genes perdidos durante o sucessivo processo de seleção à que o arroz cultivado foi submetido na busca de adaptabilidade e produtividade (Sguarezi et al., 2003). A utilização de variedades de arroz vermelho, de ampla base genética, em cruzamentos direcionados com variedades comerciais, possibilita a obtenção de grandes populações segregantes para a identificação de QTLs associados com qualidade fisiológica das sementes. O desenvolvimento de rápidas e eficientes técnicas de biotecnologia e marcadores moleculares tem auxiliado consideravelmente este processo.
No presente trabalho, uma população segregante proveniente do cruzamento entre o ecótipo de arroz vermelho FFS-45 (com o caráter germinação/emergência em grandes profundidades) e a cultivar BRS 7”taim” (sem o caráter) foi utilizada objetivando a identificação de marcadores moleculares do tipo microsatélite associados a vigor de sementes. 

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Para a escolha dos genitores, foram utilizados dados de pesquisas anteriores onde uma coleção de arroz vermelho foi primeiramente analisada do ponto de vista fisiológico e molecular para identificar as constituições genéticas que apresentaram melhores resultados em condições de emergência a grandes profundidades (Sguarezi et al., 2003) e melhor potencial de hibridização (Malone et al., 2005). Ambos os trabalhos contribuíram para a escolha do ecótipo de arroz vermelho FFS-45. A cultivar BRS – 7”Taim” foi escolhida como o outro parental por apresentar um comportamento limitado na germinação em profundidades maiores do que 5 cm. 
Um total de 30 panículas foram emasculadas e polinizadas para a obtenção das sementes híbridas F1. Estas sementes F1 foram semeadas novamente para obtenção da população F2. A população de sementes F2 foi semeada em baldes, em casa de vegetação, para a obtenção das famílias F3. Aproximadamente 30 dias após a semeadura, uma amostra de tecido foliar de cada planta F2 foi coletada para a extração de DNA, a qual foi realizada conforme protocolo descrito por Doyle & Doyle et al (1987). 
Para a avaliação fisiológica das famílias F3, 75 sementes de cada família foram semeadas a 15 cm de profundidade, em casa de vegetação. O delineamento experimental foi inteiramente casual, com 3 repetições de 25 sementes. A média das plantas emergidas para cada família F3 foi utilizada como parâmetro para identificação das plantas F2 contendo maior acumulação de genes associados à germinação em grandes profundidades. A identificação de marcadores moleculares associados ao caráter foi realizada mediante a metodologia de DNA Pooling utilizando o DNA das plantas F2. Foi utilizado um total de 270 marcadores moleculares microsatélite específicos para arroz. 
Estudos de prospecção de genes in silico foram realizados utilizando as seqüências dos marcadores microsatélite associados à característica, obtidos no estudo de associação mediante DNA Pooling. A prospecção de genes foi realizada utilizando o programa FGENESH (disponível on-line no endereço http://www.softberry.com/berry.phtml). De posse nos genes prospectados, as proteínas por eles sintetizadas foram identificadas mediante analise de similaridade dentro do banco publico de proteínas SWISS PROT (http://www.expasy.org/sprot/) 

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

	O resultado do desempenho fisiológico em grandes profundidades permitiu identificar 32 das 154 famílias F3 analisadas que apresentaram emergência em grandes profundidades (Tabela 1). O DNA das 7 famílias F3 que apresentaram os melhores desempenhos no teste fisiológico, mensurado através da percentagem de emergência, foi misturado em quantidades equimolares para a realização da analise de DNA Pooling 
A percentagem de emergência variou de 2,7% até 72%, demonstrando claramente a natureza quantitativa da característica germinação/emergência em grandes profundidades. O resultado do analise por DNA Pooling revelou 5 marcadores associados com a característica, sendo eles, os marcadores RM243 e OG79, localizados no cromossomo 1, os marcadores RM208 e OG110, localizados no cromossomo 2 e o marcador RM 206, localizado no cromossomo 11 (Figura 1). 

OG79

OG110

RM243

RM208

RM206

Figura 1. Perfil molecular dos 5 marcadores microsatélite associados à germinação/emergência de sementes em arroz. (A) Pool positivo (com o caráter); (B) Parental BRS 7 ”Taim” (sem o caráter).

	A prospecção de genes ligados aos cinco marcadores moleculares microsatélite permitiu identificar 14 proteínas associadas ao marcador RM243, 21 ao marcador OG79, 18 ao marcador RM208, 16 ao marcador OG110 e 14 ao marcador RM206.
	Dois dos marcadores microsatélite identificados, como associados ao caráter germinação/emergência, revelaram ligação com genes de conhecido efeito direto sobre o processo de germinação das sementes.
Por um lado, o marcador RM206, localizado no cromossomo 11, mostrou-se ligado a 7 genes de resistência a patógenos. Segundo Chen et al. (1997), o marcador RM206 foi identificado como ligado ao gene Pi5, que confere resistência a Magnaporthe grisea, fungo responsável pela doença conhecida como Brusone no arroz. Segundo Lucca Filho (2003), são inúmeros os relatos que citam os efeitos do ataque de patógenos das sementes sobre a qualidade fisiológica das mesmas. Por isso, estudos mais aprofundados sobre os efeitos do ataque de patógenos às sementes na população segregante utilizada neste estudo poderão ser de extrema utilidade para confirmar de que um dos fatores associados á problemas de germinação e vigor nas sementes de arroz é relacionada com a resistência ao ataque de patógenos presentes nas sementes e no solo.

Tabela 1. Número de plantas emergidas e percentagem de germinação das 32 famílias F3 que apresentaram germinação/emergência em 15 cm de profundidade.
Família F3 	Nº de plantas emergidas	% Emergência	
	Repetição 1	Repetição 2	Repetição 3		
15	2	4	0	8,0	
18	2	2	0	5,3	
22	8	8	0	21,3	
34	10	8	4	29,3*	
38	6	0	10	21,3	
42	0	4	2	8,0	
44	0	4	6	13,3	
47	0	4	0	5,3	
57	0	2	0	2,7	
61	8	0	0	10,7	
68	8	14	10	42,7*	
70	0	2	2	5,3	
75	4	2	0	8,0	
79	4	0	0	5,3	
89	0	2	2	5,3	
92	12	18	8	50,7*	
94	12	4	6	29,3*	
101	0	10	20	40,0*	
105	0	5	5	13,3	
111	6	0	4	13,3	
113	0	7	4	14,7	
115	22	20	12	72,0*	
120	16	6	10	42,7*	
137	4	0	6	13,3	
139	0	0	4	5,3	
147	14	10	8	8,0	
153	0	10	6	5,3	
156	0	8	0	21,3	
160	6	0	8	18,6	
163	0	2	0	21,3	
190	0	2	2	8,0	
197	2	0	4	13,3	

	

*Famílias selecionadas para o teste de associação molecular mediante DNA Pooling.

Outro marcador que revelou estar ligado a um gene de extrema importância no processo germinativo das sementes é o marcador RM243, localizado no cromossomo 1 (Chen et al., 1997). Este marcador co-segregou de forma homozigótica com o gene que codifica para a proteína Glucano endo-1,3 β-glicosidase, uma β-amilase que atua junto com as α-amilase na hidrolise dos enlaces O-glicosídicos durante o metabolismo dos carboidratos do endosperma no processo de germinação. Akiyama et al. (2004), realizando estudos de clonagem e expressão diferencial de enzimas hidrolíticas em arroz, identificaram o gene OsGLN2, que codifica para uma endo-1,3 β-glicosidase, com elevados índices de expressão nas fases de florescimento e germinação das sementes. Por outro lado, os mesmo autores identificaram que a expressão do gene OsGLN2 é aumentada pelo efeito in vitro do Acido Giberélico (AG), enquanto que a adição de Acido Abscísico (ABA) interrompe o processo. Isto faz sentido, considerando que o processo de germinação das sementes, e os genes que atuam neste complicado processo, são fortemente influenciados pela ação de fitohormônios, tais como AG e ABA, o que aumenta ainda mais as chances de que o gene que codifica para a proteína Glucano endo-1,3 β-glicosidase, ligado ao marcador RM243, esteja, efetivamente, envolvida na expressão do vigor nas sementes. 

4. CONCLUSÕES

- O processo germinativo das sementes revelou a ação de vários genes de efeito quantitativo;
- Foi possível identificar marcadores moleculares associados a, pelo menos, dois possíveis QTLs atuando no processo de germinação/emergência das sementes.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AKIYAMA T, PILLAI MA, SENTOKU N. Cloning characterization and expression of OsGLN2 a rice endo-1,3-beta-glucanase gene regulated developmentally in flowers and hormonally in germinating seeds. Planta, 2004, 220 (1), p.129-139.
CHEN, X., S,. TEMNYKH, Y. XU, Y.G. CHO & S.R. MCCOUCH. Development of a microsatellite framework map providing genome-wide coverage in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 1997, 95, p. 553–567.
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 1987, 12, p.13-15.
LUCCA FILHO, O. Patologia de Sementes. In: PESKE, S. T; D’AVILA ROSENTHAL, M & MEDEIROS ROTA, G. R., EDS. Sementes: Fundamentos científicos e tecnológicos. Pelotas: Editora e Gráfica Universitária (UFPel), 2003, p 225-280.
MALONE, G; ZIMMER, P. D; CASTRO, A. da S; ARIAS, L. N; MENEGHELLO, G. E; PESKE, S. T. Caracterização bioquímica e molecular de ecótipos de arroz vermelho coletados no estado de Rio Grande do Sul. Pesquisa agropecuária tropical, 2005, Protocolo PAT 673/2005.
SGUAREZI, C.N.; PESKE, S.T.; BOBROWSKI, V.L.; MOREIRA, H.L.M. Análise da qualidade fisiológica do arroz vermelho (Oryza sativa L.). Informativo ABRATES, 2003, v.13, n.3, p. 75.