Clonagem, expressão E purificação de antígenos recombinantes de Mycoplasma hyopneumoniae
SIMIONATTO, Simone1; HARTWIG, Daiane1; LUERCE, Tessália Dinis1; POHL, Paula Cristiane.2; MARCHIORO, Silvana Beutinger.3; DELLAGOSTIN, Odir Antônio1.

1Laboratório de Biologia Molecular, CenBiot/UFPel, Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. s_simionatto@yahoo.com.br
2Laboratório de Imunologia Aplicada a Sanidade Animal, CBiot/UFRGS
3Laboratório de Bacteriologia, Deptº de Medicina Veterinária Preventiva/UFSM

1.	INTRODUÇÃO
O Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), uma doença respiratória contagiosa que acomete suínos no mundo todo, causando grandes perdas econômicas ao setor suinícola (Sobestiansky et al., 1999). As vacinas comerciais ou experimentais já disponibilizadas ou em fase de testes são baseadas em antígenos nativos da bactéria (Lin et al., 2003), em antígenos recombinantes (Chen et al., 2006) ou em formulações com DNA (Chen et al., 2003). Embora existam vacinas comerciais (bacterinas) para o controle da doença, as mesmas não são produzidas no Brasil e apresentam um elevado custo de produção. Desta forma, o desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da PES é fundamental para a melhoria da sanidade dos suínos. Entretanto, o repertório de proteínas antigênicas caracterizadas e disponíveis para utilização ainda é bastante restrito, protegendo apenas parcialmente os animais (Lin et al., 2003). Recentemente, foi concluído o seqüenciamento de duas cepas de M. hyopneumoniae, uma patogênica e outra não-patogênica, pela Rede Sul de Análise de Genomas e Biologia Estrutural (PIGS - Vasconcelos et al., 2005). A partir dos dados gerados e da análise proteômica complementar, foi possível a identificação de 284 seqüências codificadoras (CDS) de proteínas antigênicas e/ou envolvidas na patogenicidade e, possivelmente, com potencial para utilização no desenvolvimento de vacinas e testes de imunodiagnóstico. Porém, como os experimentos de desafio em suínos apresentam custo elevado, é importante a seleção prévia de antígenos candidatos a vacinas que se apresentem imunogênicos em animais de laboratório. Posteriormente, os antígenos que forem capazes de induzir uma resposta imune contra a PES poderão então ser avaliados no animal alvo deste estudo, os suínos.
Entretanto, a expressão de proteínas de M. hyopneumoniae em E. coli é dificultada uma vez que o código genético do M. hyopneumoniae possui o codon TGA codificando para o aminoácido triptofano enquanto que em E. coli, TGA é um codon de terminação. No entanto, a substituição na seqüência do DNA do codon TGA para TGG, o qual codifica para o aminoácido triptofano em E. coli, possibilita a expressão de proteínas de M. hyopneumoniae em sistemas heterólogos. 
Este trabalho teve por objetivo a clonagem, expressão e purificação de antígenos de M. hyopneumoniae em E. coli, visando o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a PES. A realização deste projeto permitirá a identificação e caracterização de novos alvos potencialmente antigênicos e o desenvolvimento de vacinas de subunidade, sendo, portanto, um passo importante na definição de estratégias alternativas para produção de insumos eficientes no controle da doença.

2.	MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Análise das CDS identificadas pelo grupo PIGS: As 284 CDS da cepa 7448 de M. hyopneumoniae identificadas pelo PIGS foram analisadas com analisadas com o auxílio dos programas de bioinformática PFAM, SWISS-PROT, PROSITE, NNPREDICT, VECTOR, buscando satisfazer características como: possível envolvimento das proteínas codificadas em aspectos relacionados à patogenicidade e/ou à antigenicidade, seqüências hidrofílicas com poucos ou nenhum codon de triptofano.
2.2. Clonagem, expressão e purificação das proteínas recombinantes de M. hyopneumoniae: As seqüências das CDS selecionadas da cepa 7448 de M. hyopneumoniae foram amplificadas por PCR com Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen). Os primers utilizados na amplificação foram desenhados a partir da seqüência da cepa 7448 depositada no GenBank, números de acesso NC_007332. Os fragmentos gerados na amplificação foram submetidos à clonagem direcional no vetor de expressão Champion pET200D/TOPO Hist-tag (Invitrogen) e transformados por eletroporação em E.coli TOP10. As seqüências que continham codons TGA foram submetidas à mutagênese sítio-dirigida, com o auxílio da técnica de PCR. Estes genes foram amplificados em dois segmentos, tendo o primer reverso do primeiro segmento e o forward do segundo segmento a seqüência alterada de TGA para TGG. Estes dois segmentos possuem uma sobreposição de pelo menos 12 nucleotídeos o que permite, numa segunda PCR utilizando os dois segmentos amplificados, a extensão de todo o gene (Simionatto et al, 2006). Os fragmentos gerados nesta PCR foram clonados conforme citado acima.
Os clones recombinantes foram expandidos em caldo Luria-Bertani (LB, Difco) suplementado com 100 g de canamicina, seguido de uma extração de DNA e caracterização enzimática. Os plasmídios selecionados foram transformados na cepa de expressão E. coli BL21 Star competente, cultivadas em LB com canamicina até a fase log de crescimento e induzidas por 3 h com 0,3 mM de IPTG. A purificação das proteínas recombinantes foi realizada por cromatografia de afinidade em coluna de sepharose (HisTrap™) carregada com níquel, usando o sistema ÄKTA-Prime (Amersham Biosciences). A pureza das mesmas foi determinada através SDS-PAGE e a sua concentração pelo método de Bradford (Bradford, 1976)
2.3. Inoculação de camundongos com as proteínas recombinantes e avaliação da resposta imune: As proteínas recombinantes purificadas foram utilizadas na inoculação de camundongos BALB/c fêmeas com 7 semanas de vida. Foram administradas duas doses intramuscular (IM) com 50 µg de proteína, com intervalo de 21 dias entre cada dose. Foi utilizando 15% de hidróxido de alumínio como adjuvante. O soro dos animais será monitorado por ELISA utilizando como antígeno às proteínas purificadas e células totais de M. hyopneumoniae, e resultado servirá para avaliar a capacidade destas proteínas induzirem uma resposta imune humoral que reconheça as proteínas nativas.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Análise das CDS: Trinta e um alvos de expressão pertencentes a 25 diferentes CDS foram selecionados para clonagem e expressão em E. coli (Tabela 1).

Tabela 1. Antígenos de M. hyopneumoniae clonados, expressos, purificados e inoculados em camundongos. Os asteriscos indicam o número de TGA substituídos por TGG.

3.2 Clonagem, expressão e purificação das proteínas recombinantes de M. hyopneumoniae: As CDS selecionadas foram amplificadas e o sistema de clonagem direcional no vetor Champion pET200D/TOPO mostrou-se eficiente o que possibilitou a clonagem de 29 antígenos de M. hyopneumoniae. Foram obtidas várias cepas de E. coli expressando 16 proteínas recombinantes e destas, 15 já foram purificadas por cromatografia de afinidade (Tabela 1). A Figura 1 demonstra algumas das proteínas purificadas.

Figura 1. SDS-PAGE 15 % de 10 proteínas recombinantes de M. hyopneumoniae expressas em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade.

1     2     3    4    5     6     7     8    9    10

1. NrdF
2. P42
3. MHP0657 N-terminal (P115)
4. MHP0348
5. MHP0627
6. MHP0390
7. MP4342 (P102)
8. MP21517 central (P146)
9. MP21517 C-terminal (P146)
10. 10664

Das 16 proteínas purificadas, 13 já foram inoculadas em camundongos (Tabela 1). A coleta de sangue destes animais será realizada até 90 dia após a segunda dose, quando serão realizados os testes de imunogenicidade destes antígenos recombinantes através do ELISA.

4. CONCLUSÕES
	Estes resultados permitem concluir que a estratégia de clonagem direcional no vetor no vetor Champion pET200D/TOPO Hist-tag foi eficiente uma vez que permitiu a clonagem de um grande número de antígenos de M. hyopneumoniae. A metodologia desenvolvida para mutagênese sítio-dirigida possibilitou a expressão de antígenos de M. hyopneumoniae em E. coli, sendo possível a purificação destas proteínas recombinantes em quantidades suficientes para os estudos de imunogenicidade em camundongos. Estas proteínas estão sendo analisadas em Western blot utilizando-se soro de suínos naturalmente infectados para determinar sua capacidade de reagir com anticorpos produzidos durante a infecção. 

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72, p. 248-254.
CHEN, Y.L.; WANG, S.N.; YANG, W.J.; CHEN, Y.J.; LIN, H.H.; SHIUAN, D. Expression and Immunogenicity of Mycoplasma hyopneumoniae Heat Shock Protein Antigen P42 by DNA Vaccination. Infection and Immunity, 2003, 71, p. 1155-1160.
CHEN, A.Y.; FRY, S.R.; FORBES-FAULKNER, J.; DAGGARD, G.E.; MUKKUR, T.K.S. Comparative immunogenicity of M. hyopneumoniae NrdF encoded in different expression systems delivered orally via attenuated S. typhimurium aroA in mice. Veterinary Microbiology, 2006, 114, p.252-259.
LIN, J.H.; WENG, C.N.; LIAO, C.W.; YEH, K.S.; PAN, M.J. Protective Effects of Oral Microencapsulated Mycoplasma hyopneumoniae Vaccine Prepared by Co-Spray Drying Method. Journal Veteterinary Medicce Science, 2003, 65, p. 69-74.
SIMIONATTO, S.; Luerce, T.D.; Marchioro, S.; Quevedo, M.F; Dossa, R.G; Ribeiro, S.G.; Dellagostin, O.A. Mutagênese sítio-dirigida visando a clonagem e expressão de genes de Mycoplasma hyopneumoniae em Escherichia coli. Anais do 520 Congresso Brasileiro de Genética, 2006, Foz do Iguaçú, p. 896.
SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D.; MORES, N.; et al. 1999. Pneumonia enzoótica. In: Clínica e Patologia Suína. 2a ed., Art 3 Impressos Especiais, Goiânia, Goiás, p.359.
VASCONCELOS, A.T.R.; FERREIRA, H.B.; BIZARRO, C.V.; et al. Swine and poultry pathogens: the complete genome sequences of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae. Journal of Bacteriology, 2005, 187, p. 5568-5577.