AVALIAÇÃO DA MELANINA EM ISOLADOS SELVAGENS DE Sporothrix schenckii DURANTE INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL EM MODELO MURINO

MATTEI, Antonella Souza1; MADRID, Isabel Martins2; CLEFF, Marlete Brum3; SANTIM, Rosema4; ANTUNES, Tatiana2; MEINERZ, Ana Raquel3; MEIRELES, Mário Carlos Araújo4; NOBRE, Márcia de Oliveira5.

1 – Bolsista de Iniciação Científica, CNPq - Laboratório de Doenças Infecciosas – Setor Micologia – Faculdade de Veterinária - Universidade Federal de Pelotas (UFPel) antonella.mattei@hotmail.com
2 – Programa de Pós-Graduação em Veterinária – Faculdade de Veterinária – UFPel
3 – Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária – UFRGS 
4  – Laboratório de Doenças Infecciosas – Setor Micologia – Faculdade de Veterinária- UFPel
5 – Hospital de Clínicas Veterinária, UFPel

INTRODUÇÃO

A esporotricose é uma micose subcutânea, de evolução subaguda ou crônica, que tem como agente etiológico o fungo dimórfico Sporothrix schenckii, que acomete o homem e uma grande variedade de animais. Na natureza o fungo é encontrado sob a forma micelial no solo e plantas, passando a forma leveduriforme quando em parasitismo (Findlay & Vismer, 1986; Nobre et al., 2003). 
Uma grande variedade de fungos apresenta fatores que os auxiliam na sua sobrevivência, tanto no ambiente quanto no hospedeiro, que são os fatores de patogenicidade. Pouco é conhecido sobre os fatores que contribuem para a virulência do S. schenckii, no entanto, alguns são estudados por diversos pesquisadores como a termotolerância, dimorfismo, enzimas extracelulares e a melanina (Nobre et al., 2005).
As melaninas são pigmentos marrons escuros ou pretos, produzidas por microrganismos, plantas e animais, compostos de vários tipos de monômeros fenólicos ou indólicos, geralmente combinadas com proteínas ou com carboidratos. Estes pigmentos não são essenciais para o crescimento e desenvolvimento fúngico, mas aumentam a chance de sobrevivência e competitividade no meio ambiente (Jacobson, 2000; Nobre et al., 2004).
A mais bem caracterizada melanina fúngica é a melanina DHN (1,8 dihidroxinaftaleno), também conhecida como melanina pentacetídeo, que ocorre em muitos ascomicetos e deuteromicetos. O mecanismo pelo qual os pigmentos aumentam a virulência nos fungos não é conhecido, mas estudos desenvolvidos, demonstram que a melanina é um importante fator de virulência, conferindo tolerância contra estresses ambientais como irradiação ultravioleta e dissecação, e proteção contra a ação do sistema de defesa do hospedeiro (Doering et al., 1999;  Jacobson, 2000; Tsai et al., 1998).
A presença dos grânulos de melanina DHN na parede dos conídios de S. schenckii foi documentada por Romero-Martinez et al. (2000), os quais observaram que células melanizadas foram mais resistentes a ação de fagócitos do que as células que não apresentavam melanina. Morris-Jones et al. (2003) demonstraram, através de microscopia eletrônica de transmissão, a presença de uma fina camada de melanina na célula leveduriforme do S. schenckii, embora as colônias tivessem mantido coloração creme. 
Esse trabalho tem por objetivo avaliar o comportamento da melanina em isolados pigmentados de Sporothrix schenckii durante inoculação experimental em modelo murino.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 60 ratos albinos (Rattus norvergicus) de linhagem Wistar (cepa UFPel), machos, com sete semanas de idade, divididos em dois grupos de 30 animais cada, controle (CONT) e o inoculado com S. schenckii pigmentado (MEL+). Os animais foram acompanhados durante nove semanas, recebendo ração comercial e água ad libitum.
Para a preparação do inóculo utilizou-se isolado de Sporothrix schenckii, pigmentado e termotolerante, proveniente de caso clínico de esporotricose felina. O isolado foi cultivado em placas contendo ágar Sabouraud com cloranfenicol e cicloheximida, incubadas à temperatura de 25ºC, por sete dias. Após, as colônias foram removidas com auxílio de estilete, centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS (solução salina tamponada), homogeneizadas e padronizadas na escala de MacFarland (tubo 4).
A inoculação foi realizada por via subcutânea no coxim plantar esquerdo e direito dos membros posteriores de todos animais, sendo que o grupo MEL+  recebeu 0,2 mL do inóculo contendo 2x103 células de S. schenckii/mL e o grupo CONT 0,2 mL de PBS. Houve acompanhamento semanalmente durante nove semanas do experimento para a confirmação da inoculação e observação do desenvolvimento das lesões.
Foram realizadas biopsias nas duas primeiras semanas do experimento, a cada três dias, devido esta fase ser de transição da forma filamentosa para leveduriforme, posteriormente, foram realizadas a cada quinze dias, totalizando oito biópsias. Para a obtenção das amostras os animais foram anestesiados com xilazina (0,6mg/100gr) e ketamina (4,4mg/100gr) e realizada a biópsia do tecido do coxim plantar direito, com o auxílio de punch de 6mm de diâmetro, as quais foram enviadas para realização de estudo micológico e ultraestrutural. 
No exame micológico, as amostras foram cultivadas em duplicata, em placas de Petri contendo ágar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol, incubadas a 25ºC e 37ºC por até 10 dias, para o retroisolamento do agente e confirmação do dimorfismo. O estudo ultraestrutural das células fúngicas foi realizado através da microscopia eletrônica de transmissão (MET), as amostras foram fragmentadas, fixadas em solução de glutaraldeído 2% em tampão cacodilato de sódio, desidratadas em uma série de concentração crescente de etanóis e incluídas em Epon. Posteriormente, os cortes semifinos foram corados com azul de metileno e em áreas selecionadas dos blocos foram feitos cortes ultrafinos contrastados por acetato de uranila e citrato de chumbo e observados em microscópio eletrônico de transmissão.
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os animais do grupo MEL+ desenvolveram lesões inicialmente nodulares nos locais de inoculação que na terceira semana evoluíram para úlceras em 63,3% dos animais, passando a crostas. A partir da sétima semana observou-se em 10% dos animais, processo de cicatrização do ponto de inoculação. Também foram observadas lesões em outras regiões corpóreas a partir da 3ª semana e recidiva das lesões nas semanas oito e nove. No grupo CONT verificou-se, na primeira semana, edema do local de inoculação, o qual desapareceu nas semanas seguintes do experimento. Isto é explicado, pois a melanina DHN dos conídios é considerada um fator de patogenicidade, protegendo-o contra a ação de fagócitos dificultando a resposta imunológica, determinando assim a gravidade das lesões (Romero-Martinez et al., 2000).  A melanina foi importante na patogenicidade de isolados de S. schenckii, demonstrado por estudo iniciado em 2001, utilizando dois isolados de S. schenckii pigmentado (MEL+ A e MEL+ B) e albino (MEL- A e MEL- B), sendo observado que o inóculo contendo conídios pigmentados desenvolveu esporotricose de maior gravidade em modelo experimental quando comparada à induzida por conídio mutante albino (Nobre et al., 2005).
O retroisolamento do agente foi obtido em todas as amostras do grupo MEL+ e em nenhuma do grupo CONT, sendo o dimorfismo confirmado pelo crescimento do fungo a 25º e 37ºC. O exame macromorfológico da fase filamentosa demonstrou colônias de coloração marrom a marrom escura que microscopicamente eram caracterizadas por hifas finas, hialinas, septadas e ramificadas com conídios ao longo das hifas ou no ápice do conidióforo, semelhante a uma margarida. Nas culturas incubadas a 37ºC, observaram-se colônias cremosas de coloração creme que na microscopia eram caracterizadas por pequenas células esféricas, ovais ou alongadas, que se assemelhavam a “charutos”.
Nas amostras dos dias três e sete após a inoculação, o estudo ultraestrutural demonstrou a presença de células em fase de transição, com a camada de melanina desprendendo-se da parede da célula fúngica, inexistindo na amostra do dia dez. A partir da terceira até a nona semana observou-se a presença de grânulos de melanina ao redor da célula leveduriforme, os quais variaram de intensidade. Estes resultados demonstram a presença de melanina na fase leveduriforme, comprovando assim, que o agente possui capacidade de sintetizar melanina durante a fase parasitária. Outros estudos comprovaram a presença de melanina na forma micelial in vitro (Nobre et al., 2003; Morris-Jones et al., 2003), enquanto que na forma leveduriforme in vivo, detectaram componentes que poderiam ser melanina através de anticorpos monoclonais, em tecidos de animais experimentais inoculados com S. schenckii (Morris-Jones et al., 2003).

CONCLUSÃO

O trabalho demonstrou que o S. schenckii possui a capacidade de sintetizar melanina tanto na forma micelial como na leveduriforme.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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MORRIS-JONES, R.; YOUNGCHIM, S.; GOMEZ, B.L.; AISEN, P.; HAY, R.J.; NOSANCHUK, J.D.; CASADEVALL, A.; HAMILTON, A.J. Synthesis of melanin-like pigments by Sporothrix schenckii in vitro and during mammalian infection. Infection and Immunity, v.71, p. 4026-4033, 2003

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