AVALIAÇÃO DO USO DA AgNOR COMO FERRAMENTA PROGNÓSTICA PARA TUMORES MAMÁRIOS CANINOS

MENDES, Tatiane Camacho1; DIAS, Márcia Feltrin1; GUIM, Thomas Normanton1; BORNEL-RAPOSO, Joseane2; GEVEHR-FERNANDES, Cristina2
	
1Programa de Pós-graduação, Faculdade de Veterinária – UFPe l- tatianecamacho@yahoo.com.br
2Dept° de Patologia Animal, Faculdade de Veterinária – UFPel

1.	INTRODUÇÃO
Em medicina veterinária os fatores preditivos para tumores, tais como, comportamento biológico, avaliação anatomopatológica, comprometimento dos linfonodos e tamanho tumoral não estão ainda bem fundamentados (van Diest et al., 2004). Uma das características mais importantes da transformação neoplásica é o descontrole do ciclo celular, e esta alteração está também envolvida na expansão clonal de uma população tumoral maligna (Ceccarelli et al., 2000; Korneyev et al., 2000). Este aspecto é considerado como uma das maiores e mais poderosas ferramentas para se prever o comportamento neoplásico (Ceccarelli et al., 2000).
A avaliação quantitativa das proteínas associadas às regiões organizadoras nucleolares (NORs) coradas pela prata (Ag) (Derenzini, 2000; Treré, 2000; Yazdi & Taghavi, 2005) foi introduzida como um indicador da atividade proliferativa da célula neoplásica (Ceccarelli et al., 2000; Oshima & Fonores, 2001). Por ser a velocidade de crescimento da massa tumoral o fator mais importante que influencia o curso clínico do câncer, o crescimento mais rápido sugeriu a explicação de pior prognóstico de cânceres com altos valores de AgNOR, comparado com outros que possuam baixos valores (Derenzini, 2000).
O presente trabalho teve como objetivo verificar se existe correlação entre os índices de AgNOR e o potencial de malignidade dos tumores mamários caninos, definido pelos métodos tradicionais de classificação.
2.	MATERIAIS E MÉTODOS
Para o estudo 45 carcinomas e 4 adenomas mamários caninos, provenientes de biopsias excisionais ou de necropsias, foram recuperados dos arquivos do Laboratório Regional de Diagnóstico (LRD) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Utilizou-se material incluso em parafina, do qual foram confeccionadas lâminas histológicas, os quais foram coradas pelo método de AgNOR e com hematoxilina-eosina para análise por microscopia óptica de luz.
Para definir a freqüência de AgNOR, foram contados os pontos marrom-acastanhados no interior dos núcleos em 100 células epiteliais tumorais, distribuídas em 5 campos aleatórios na periferia do tumor, em objetiva de 100x com o auxílio do óleo de imersão. A freqüência AgNOR/núcleo de cada tumor mamário avaliado foi obtido dividindo-se o número total de AgNORs por 100 (Kravis et al., 1996).
Para a análise da morfológica descritiva, as lâminas histológicas, coradas com hematoxilina-eosina foram analisadas pelo método de classificação, apresentado por Misdorp (2002) e apoiado pela Organização Mundial de Saúde/Instituto de Patologia das Forças Armadas Americanas (OMS/AFIP), e a graduação histológica foi realizada considerando o método de Elston & Ellis (1991) (Figura 1). 
A análise estatística foi realizada usando o programa Statisticx (Statistix. 2003. Statistix 8 analitycal software. Tallahassee, FL). Foram realizadas comparações entre os valores de AgNOR/núcleo encontrados nos 49 tumores e os métodos de classificação histológica utilizados no estudo.  Para tal escolheu-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis para amostras independentes, pelo fato dos dados não apresentarem uma distribuição normal.
Figura 1 – Resumo do método semi-quantitativo para avaliação do grau histológico em carcinomas mamários como proposto por Elston & Ellis (1991)
Aspecto	Escore	
Formação tubular		
Boa formação tubular (acima de 75%)	1	
Moderada formação tubular (entre 10 e 75%)	2	
Pouca ou nenhuma formação tubular (10% ou menos)	3	
Pleomorfismo nuclear		
Pequeno, células uniformes e regulares	1	
Moderado aumento no tamanho e variabilidade celular	2	
Marcada variação	3	
Contagem mitótica		
0 – 7	1	
8 – 16	2	
maior que 17	3	
Total do escore	Grau de malignidade	
3 - 5
6 – 7
8 – 9	I
II
III	
Fonte: Elston & Ellis (1991) 
3.	
AgNOR

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O interesse dos patologistas nas proteínas AgNORs aumentou muito por volta do final dos anos 80 (Treré, 2000). Existem relatos de que a contagem das AgNORs possui significado prognóstico em vários tipos de tumores humanos e caninos (Simões et al., 1994; Kravis et al., 1996; Oshima & Forones, 2001; Yazdi & Taghavi, 2005), como também mostra-se eficiente na distinção entre lesões benignas e malignas, bem como pode ser correlacionado com o grau de malignidade de certos neoplasmas (Löhr et al., 1997; Korneyev et al., 2000; Rivero & Aguiar, 2002).
Ao aplicar esta técnica a 49 tumores mamários caninos, obteve-se uma média de 2,23 (amplitude 1,39 – 3,2; DP  0,38) AgNORs/núcleo. Resultados semelhantes aos destes estudos foram também encontrados em mastocitomas caninos, sendo que os valores médios de AgNORs/núcleo variaram de 2,2 em tumores que não recidivaram, e de 2,3 em tumores que não apresentaram metástases. Porém os mastocitomas que apresentaram comportamento mais agressivo, com recidiva e metástase possuíam valores médios de AgNORs/núcleo superiores de 2,9 (Simões et al., 1994). Resultados similares também foram encontrados por Rech et al. (2004), ao estudarem 45 mastocitomas caninos, que apresentaram média de 1,9 AgNORs/núcleo. Sendo que os matocitomas classificados com grau I, II e III apresentaram, respectivamente, médias de 1,5, 1,85 e 3,25 AgNORs/núcleo. Estes dados levam a crer que, a variação dos valores médios de AgNORs/núcleo só devem ser comparados respeitando-se cada tipo tumoral, como também seus subtipos e variantes, por estes apresentarem comportamentos proliferativos distintos.
Quando avaliamos a distribuição das AgNORs, frente a esta classificação morfológica apresentada por Misdrop (2002) e corroborada pela OMS/AFIP, pode-se evidenciar que os adenomas complexos expressaram valores médios de 1,95 (amplitude 1,39 – 2,26; DP  0,39) AgNORs/núcleo. Já os carcinomas simples apresentaram valores de AgNORs/núcleo superiores (média 2,35; amplitude 1,72 – 3,2; DP  0,38), aos carcinomas complexos (média 1,97; amplitude 1,84 – 2,35; DP  0,16). Estes dados quando comparados foram estatisticamente significativos (P < 0,0028), sendo que os carcinomas simples e complexos diferiram entre si, porém ambos não foram estatisticamente diferentes dos adenomas complexos. Sabe-se que existem diferenças prognósticas entre estes dois tipos histológicos de carcinomas (Misdorp, 2002; Monteiros et al., 2005), pois os do tipo simples possuem um prognóstico reservado, quando comparados com os carcinomas complexos (Yamagami et al., 1996; Misdorp, 2002).
Löhr et al. (1997), ao aplicarem esta técnica em tumores mamários caninos, encontraram valores inferiores aos encontrados no presente relato. Para os adenomas complexos o valor médio foi de 1,37 AgNORs/núcleo, e para os carcinomas complexos 1,42. Houve assim, diferença significativa entre tumores benignos e malignos, embora isto não tenha se mostrado como um valor preditivo para o prognóstico do tumor mamário canino.
Ao analisar a distribuição da contagem de AgNORs/núcleo, considerando o sistema de graduação histológica proposta por Elston & Ellis (1991), percebeu-se que o aumento do grau de malignidade era acompanhado pelo crescente aumento do valor médio das AgNORs. Sendo assim, os tumores classificados como grau I apresentaram uma média de 1,99 AgNORs/núcleo (amplitude 1,73 – 2,7; DP  0,27). Já os classificados como grau II, revelaram uma média de 2,25 (amplitude 1,72 – 3,2; DP  0,39), e os classificados como grau III uma maior média de 2,51 (amplitude 1,92 – 3,11; DP  0,27). A análise estatística destes dados também se mostrou estatisticamente significativa (P < 0,0003), sendo que os carcinomas grau I e III diferiram entre si, mas não dos de grau II.
A avaliação da quantidade de AgNOR nos núcleos das células é uma ferramenta única para obter informações da velocidade de biogênese ribossomal em preparações citohistopatológicas (Pich et al., 2004; Trerè et al., 2004). Dzimira et al. (2005), em seu trabalho concluíram que, a coloração com prata das NORs é um método simples e barato, defendendo estimativas da velocidade de proliferação celular e que o método confirma baixa ou alta malignidade em exames histopatológicos da rotina para tumores.
No presente relato observou-se que o aumento dos valores médios de AgNORs/núcleo era acompanhado pelo aumento da malignidade de cada tipo histológico. Isto pode ser evidenciado no adenoma complexo (média 1,95) quando comparado com o carcinoma simples (média 2,35). O mesmo foi observado na graduação histológica dos carcinomas mamários, pois os tumores classificados com grau I possuíam médias inferiores (1,99), comparados com os carcinomas grau III (2,51). Isto revela que, os valores médios de AgNORs/núcleo tendem a ser superiores em tumores que apresentam características histológicas de malignidade.
Porém ao analisar estes dados observa-se aqui a necessidade da realização de estudos prospectivos de avaliação da sobrevida dos pacientes, contrapondo-os com os dados obtidos através da avaliação da morfologia descritiva, graduação histológica e média de AgNORs/núcleo dos neoplasmas mamários, com o objetivo de evidenciar o seu real valor prognóstico na rotina veterinária.
4.	CONCLUSÕES
Com os dados apresentados neste estudo pode-se concluir que a média de AgNOR/núcleo tende a elevar-se em tumores que apresentem características histológicas de malignidade. Isto é melhor observado no carcinoma simples e nos tumores classificados histologicamente como grau III.
5.	REFERÊNCIAS
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