INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO MICELIAL DE Colletotrichum spp. CAUSADO POR FILTRADOS DE BACTÉRIAS COM POTENCIAL BIOCONTROLADOR

SILVA, Aline Scheer1; SILVA, Luzia Pereira1*; UENO, Bernardo2, BITTENCOURT, Andréa Moura1

1Universidade Federal de Pelotas, Depto. de Fitossanidade, C.P. 354, 96010-900, Pelotas, RS, 2Embrapa Clima Temperado, C.P. 403, 96001-970, Pelotas, RS. E-mail: alinescheer@bol.com.br. *Bolsista do CNPq.

INTRODUÇÃO
Fungos do gênero Colletotrichum causam doenças em um grande número de plantas cultivadas, principalmente em regiões tropicais e subtropicais, onde há predominância de clima quente e úmido. Em macieira, por exemplo, espécies de Colleototrichum podem infectar folhas, frutos e ramos, causando doenças de importância econômica.
Em levantamento feito para verificar doenças na cultura da pimenta vermelha, no Sul do Rio Grande do Sul, foi constatado que fungos do gênero Colletotrichum, causaram perdas acima de 50% na maioria das lavouras, e em alguns casos houve perda total da produção (SILVA et al, 2005).
Apesar do controle da antracnose se basear na pulverização de fungicidas, vários estudos têm mostrado que o uso intensivo destes produtos tem favorecido o surgimento de populações do fungo resistentes aos fungicidas, como foi mostrado nos trabalhos sobre o uso intensivo de benomil no controle da antracnose em mangueira e cereais (Dodd et al., 1991; Waller, 1992). Aplicações não programadas podem ainda interferir na microflora natural das culturas, afetando os mecanismos de biocontrole e favorecendo de alguma forma o aumento na severidade da doença (Waller, 1992).
É crescente a busca por técnicas de biocontrole de doenças na agricultura. Pesquisas têm sido realizadas para identificar substâncias naturais bioativas que possam ser empregadas no manejo fitossanitário, com menor efeito negativo ao ambiente (CASTRO, 1989).
Vários estudos têm demonstrado que espécies de Bacillus são promissoras no controle de fitopatógenos, principalmente pela sua capacidade de produção de compostos antibióticos com ação antifúngica (BATISTA JÚNIOR et al., 2002; KUPPER et al., 2003).
Por esse motivo, o uso do biocontrole é uma alternativa para redução no uso de fungicidas. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de inibição de filtrados de quatro isolados de bactérias, com potencial biocontrolador, pelo método de antibiose in vitro, sobre 66 isolados de Colletotrichum spp. oriundos de diferentes regiões e de vários hospedeiros.

MATERIAL E MÉTODOS
Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Clima Temperado.
As bactérias utilizadas no experimento foram obtidas a partir de isolados contaminantes que apareciam sobre o meio de cultura cultivado com isolados de Colletotrichum spp. e que inibiam o crescimento micelial do fungo, verificado pelo halo de inibição. Estes foram repicados para meio Kado e armazenados.
Os quatro isolados de bactérias (P3, P31, PE1 e PG1) foram repicados para o meio de cultura líquido batata-dextrose (BD) permanecendo em agitadores a 100 rpm por três dias. As suspensões resultantes de cada cultura foram centrifugadas e os sobrenadantes (filtrados) congelados e mantidos a -20oC até o momento de sua utilização nos testes in vitro. Para os testes de antibiose, o sobrenadante obtido foi filtrado em filtro Millipore de 0,22 μm antes de sua adição ao meio de cultura. 
Sessenta e seis isolados de Colletotrichum oriundos de frutos, folha, caule, inflorescência e pecíolos de planta de pimenta, pimentão, pêssego, manga, morango, maçã, uva, mamão, erva mate e maracujá, de diferentes cultivares e genótipos foram utilizados neste estudo. Eles foram coletados no município de Turuçu, Pelotas, Três Forquilhas e em outros Estados do Brasil.
Os materiais coletados foram levados ao laboratório e, em condições assépticas, procedeu-se a retirada dos tecidos necrosados, com auxilio de um bisturi, escolhendo-se os tecidos das margens das lesões para o isolamento do fungo. Logo após, fez-se a desinfestação dos tecidos, com álcool à 70%, e hipoclorito de sódio à 1,25% por 1 minuto. Em seguida, cada fragmento foi colocado no centro de placas de Petri de 9 cm de diâmetro, contendo o meio de cultura BDA. Estas foram incubadas a 24oC sob regime de 12 horas de luz/ 12 horas de escuro, onde permaneceram por um período de sete dias.
Ao término do período de incubação, fez-se lâminas dos fungos desenvolvidos nas placas, e estas foram observadas, e comparadas ao microscópio ótico com as características morfológicas do fungo Colletotrichum spp.
Para este estudo foram utilizadas culturas monospóricas de Colletotrichum spp., que foram obtidas através do seguinte procedimento: diluição de massa de esporos em cerca de 10mL de água estéril, após isso, 100µL desta diluição foi transferida, com auxílio de uma micropipeta de 100µL, para cada placa de Petri contendo meio água-ágar (AA) 4%. A placa foi incubada por 24 horas. Decorrido o tempo, a placa foi observada sob microscópio estereoscópico e um único esporo germinado foi coletado com a ponta de um bisturi n. 11, sendo este transferido para uma outra placa de Petri contendo meio BDA, que foi incubada em seguida.
As culturas foram preservadas em tubos de ensaio contendo meio de BDA em câmara-fria (15oC) e mantidas através de repicagens periódicas. Visando preservação a longo prazo, disco de meio contendo micélio dos diferentes isolados foi transferido para tubos com tampa rosqueada contendo água estéril e mantidos em câmara-fria à 15oC.
Para o ensaio de antibiose in vitro, um disco de micélio do fungo de 6mm foi colocado no centro de uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro, contendo o meio de cultura BDA. As placas foram incubadas por quatro dias a 24oC e fotoperíodo de 12 horas. Decorrido este período, com o auxilio de um furador de rolha de 6 mm de diâmetro, fez-se dois furos a quatro cm de distância da borda da colônia do fungo, em seguida adicionou-se 100µL do filtrado, sendo que para cada furo foi usado um filtrado bacteriano diferente. Para a testemunha foi utilizado filtrado contendo apenas meio de cultura de BD. Cada tratamento consistiu de três repetições. Aos três dias após aplicação dos filtrados, avaliou-se o crescimento do micélio nas placas. Zonas de inibição de crescimento micelial do patógeno foram consideradas como indicativas de antibiose.
Os resultados foram dados em porcentagens de inibição do crescimento micelial, em relação à testemunha, que consistiu na seguinte fórmula: I = 100- (100*B /T), onde: I – porcentagem de inibição; B – raio médio das colônias do fungo na presença de filtrados bacterianos e T – raio médio das colônias testemunhas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os filtrados apresentaram ampla variação quanto à atividade antifúngica in vitro, inibindo o crescimento micelial da maioria dos isolados de Colletotrichum testado, sendo que nenhum destes foi capaz de inibir completamente o desenvolvimento do patógeno e a maioria produziram halo de inibição. 
O número de isolados de Colletotrichum spp., que tiveram o crescimento micelial inibido pela adição de filtrados, foi 55 para o filtrado P3, 54 para o P31, 56 para os filtrados PE1 e PG1 (Tabela 1). Isto é um indicativo de que estes filtrados apresentam alguma substância que atua na inibição do fungo em questão. O uso de substâncias derivadas do metabolismo de rizobactérias tem se mostrado promissor no controle de C. acutatum em citros (Citrus spp.), e no caso específico da rizobactéria Bacillus subtilis, a antibiose parece ser o principal mecanismo de supressão de fungos (KUPPER et al., 2003).
Os filtrados dos isolados P3 e PG1 inibiram 78% do crescimento micelial no isolado 31, identificado molecularmente como C.acutatum por SILVA et al. (2006), obtido da pimenta vermelha. Observou-se inibição acima de 20% em 34 isolados com o filtrado P3; em 31 isolados com o filtrado PG1; em 8 isolados com o filtrado P31 e em 5 isolados com o uso do filtrado PE1 (Tabela 1). Estes resultados corroboram com trabalho feito por KUPPER et al. (2003) que mostrou o efeito antifúngico de filtrados bacterianos sobre o crescemento micelial de C. acutatum. 
O filtrado P31 foi o que apresentou o maior número de isolados de Colletotrichum spp. onde não houve inibição (Tabela 1). Os resultados mostraram que os filtrados PE1 e P31 foram menos eficientes que os isolados P3 e PG1, pois apresentaram maior número de isolados nas menores faixas de inibição de crescimento micelial (Tabela 1). Entre os mecanismos de antagonismo, a antibiose, possivelmente, é o que está mais relacionado aos efeitos observados neste estudo. Em outros trabalhos também se evidencia grande variabilidade de resultados em estudos de antagonismo de rizobactérias aos fungos fitopatogênicos de diversas culturas. Diferentes isolados, mesmo que pertencentes a um único gênero ou espécie de rizobactéria, apresentam efeitos variáveis no controle de um dado patógeno (BATISTA JÚNIOR et al., 2002; FREITAS & PIZZINATTO, 1997; KUPPER et al., 2003).
Pelo que foi observado no presente estudo, a inibição destes filtrados sobre crescimento micelial de Colletotrichum spp., principalmente do C. acutatum, justifica o desenvolvimento de pesquisas adicionais.

CONCLUSÃO
Existe inibição do Colletotrichum a partir dos filtrados testados.

BIBLIOGRAFIA
BATISTA JÚNIOR, C. B.; ALBINO, U. B.; MARTINES, A. M.; SARIDAKIS, D. P.; MATSUMOTO, L. S.; AVANZI, M. A.; ANDRADE, G. Efeito fungistático de Bacillus thuringiensis e de outras bactérias sobre alguns fungos fitopatogênicos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 37, n. 8, p. 1189-1194, ago. 2002.
CASTRO, A. G. Defensivos agrícolas como um fator ecológico. Jaguariúna: EMBRAPA- CNPDA, 1989. 20 p. (Documento, 6).
DODD, E. J.C.; MATCHAM, J.; JEFREIES, P. & JEGER, M.J. The effect of climatic factors on Colletotrichum gloeosporioides causal agent of mango antracnose, in the Phillipines. Plant Pathology 40: 568-575, 1991.
FREITAS, S. S.; PIZZINATTO, M. A. Ação de rizobactérias sobre a incidência de Colletotrichum gossypii e promoção de crescimento em plântulas de algodoeiro (Gossypium hirsutum). Summa Phytopathologica, Piracicaba, v. 23, n. 1, p. 36-41, jan./mar. 1997.
KUPPER, K. C.; GIMENES-FERNANDES, N.; GOES, A. Controle biológico de Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura dos frutos cítricos. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 28, n. 3, p. 251- 257, set. 2003.
SILVA, L. P.; UENO, B.; MOURA, A. B. Antracnose causa severas perdas na produção de pimenta vermelha no Sul do Rio Grande do Sul. In: XXXVIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia, 2005, Brasília. Fitopatologia Brasileira. Fortaleza: Sociedade Brasileira de Fitopatologia, v. 30. p. 76-76, 2005.
SILVA, L.P.; DEGENHARDT, J.; UENO, B.; MOURA, A.B. PCR-based detection of Colletotrichum acutatum on red pepper (Capsicum baccatum var. pendulum). CONGRESSO BRASILEIRO DE GENÉTICA, 52°. Resumos. Foz do Iguaçu – PR, 2006. CD-Rom.
WALLER, J. M. Colletotrichum diseases of plantation and other cash crops. In: JEGER, M.J.; BAILEY, J.A. Colletotrichum diseases - Biology, Pathology and Control. CAB International, Wallingford, UK, 1992, p. 167-185.

Tabela 1. Número de isolados de Colletotrichum spp. que tiveram o crescimento micelial inibido pela adição de filtrados, oriundos de quatro isolados de bactérias com potencial biocontrolador, em meio de cultura BDA, avaliado pela porcentagem de inibição em relação a testemunha.
Faixa de inibição (%)	Isolados bacterianos	
	P3	P31	PE1	PG1	
0	 11*	12	10	10	
> 0 ≤10	2	31	29	4	
>10 ≤ 20	19	15	22	21	
>20 ≤ 30	20	7	5	22	
>30 ≤ 40	12	1	0	8	
>40 ≤ 50	1	0	0	0	
>70 ≤ 80	1	0	0	1	
>80	0	0	0	0	
* Número de isolados de Colletotrichum spp.