TRANPOSIÇÃO DE MARCARDORES MICROSSATÉLITES DERIVADOS DE MILHO EM ARROZ

MISTURA, Claudete Clarice1; CASTELO BRANCO, Juliana S1; MAIA, Luciano1;  FARIAS, Daniel1; AHLERT, Renata Juliana1; MARINI, Naciele1 ;CARVALHO, Fernando I. Felix1; COSTA DE OLIVEIRA, Antônio1; 

1Centro de Genômica e fitomelhoramento – CGF – FAEM – UFPEL
Campus Universitário - Caixa Postal –CEP 96010-900
c.mistura@uol.com.br 

1.	INTRODUÇÃO

O arroz (Oryza sativa L.) é um dos cereais mais semeados no mundo, sendo explorado economicamente em todos os continentes; além disto, possui destaque por ser um alimento nutritivo, rico em carboidratos e por participar da dieta de mais da metade da população mundial (Abadie et al., 2005). Nos últimos anos, o arroz tem se constituído numa espécie modelo para estudos de natureza genética por possuir um genoma pequeno (389 Mb) colinearidade com outros cereais e de grande importância econômica e social (Zimmer, et al., 2003). 
Atualmente, existem técnicas de biologia molecular que facilitam o estudo da relação entre espécies a fim de demonstrar a presença de regiões similares ou homólogas entre os genomas daquelas taxonomicamente próximas, pois se tem como pressuposto que muitas destas espécies apresentam um ancestral em comum. Marcadores Microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeat) são regiões de repetições em série (tandem) que podem ocorrer nas formas de dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros e hexâmeros (Morgante & Olivieri, 1993). O uso desta classe de marcadores é bastante promissor, pois estes locos são os que apresentam maior freqüência de mutações em todos os genomas e em todas as espécies animais e vegetais.
Vários trabalhos mostram que grande parte dos marcadores SSR encontrados numa espécie podem ser transferidos para espécies correlatas. Este tipo de estudo tem sido denominado “transposição de marcadores” (Nassi et al., 2005). Neste sentido, o referido trabalho teve como objetivo testar a transposição de marcadores microssatélites desenvolvidos para genomas de milho em arroz.

2. MATERIAL E MÉTODOS

	O trabalho foi desenvolvido no Centro de Genômica e Fitomelhoramento da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel-UFPel. A extração do DNA foi realizada a partir de plantas de arroz obtidas no Centro de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado (CPACT/EMBRAPA), de acordo com o protocolo descrito por Saghai-Maroof et al. (1984). 
	A amplificação foi realizada em um termociclador modelo MJ. PTC 100. O SSR PCR foi desenvolvido numa reação de 15 l contendo 50 ng de DNA, tampão de PCR 1x (20 mM Tris-HCl com pH 8,4, 50 mM de KCl e 4mM de Cl2Mg), 1,9 l de dNTPs, 6,36 l de H2O, 0,34 l  de MgCl, 0,1 l de Taq DNA polimerase e 1,65 l de cada primer. O programa de amplificação foi executado como segue: 1ª etapa - ciclo inicial de desnaturação a 94 °C por 3 minutos; 2ª etapa - ciclo de desnaturação a 94 °C por 45 segundos; 3ª etapa - anelamento a 57 °C por 1 minuto; 4ª etapa - extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos. O processo foi repetido por 39 vezes a partir da 2ª etapa, finalizando com um ciclo de extensão a 72 °C por 5 minutos. O produto da amplificação foi separado em gel de agarose 3% e visualizado por meio de coloração com brometo de etídeo.
	Foram utilizados 21 conjuntos de primers sintetizados a partir do genoma do milho (Tabela 1), flanqueando 21 locos microssatélites, os quais foram testados no genótipo de arroz BRS Firmeza para avaliar a transposição dos marcadores SSR. 

Tabela 1- Primers para locos SSR em cloroplastos de milho(Zea mays L.), FAEM/UFPel, 2006

Primer	Foward	Reverse	
BMC1506	AAAAGAAACATGTTCAGTCGAGCG	ATAAAGGTTGGCAAAACGTAGCCT	
BMC 1055	CTCCAACTTGCACTCTCCAGTCTC	TTCTGCCAGCTGCAATAATCTTCT	
BMC 1338	GCAAAAATTGAAACGTGGGAGTTA	GTATAGTTTGTGAGGCTTCGCCAT	
BMC 1017	GAAGAGGTAAGGACGACGACGA	GCACCTGCAGTGAACGTCAGTA   	
BMC 1246	TCGAGTTTGCTTCTCTCCAGTTTC 	TGCAGCATATGGCTCTTTATTCAA 	
BMC 1006	AATCGCTTACTTGTAACCCACTTG 	AGTTTCCGAGCTGCTTTCTCT    	
BMC 1012	TTCTTGCGGACCTCAAACTTGT   	CTCCATCACCACTCAGAATGTCA  	
BMC 1740	TACGGCTCAATTCCAGGAAAATAA 	ATTGTGCTTGCCTGCTAGAGTACC 	
BMC 1413	CATACACCAAGAGTGCAGCAAGAG 	GGAGGTCTGGAATTCTCCTCTGTT 	
BMC 1185	AGTAAAAGAGGCAAGGACTACGGC 	GCGGCGATATATACGAGGTTGT   	
BMC 1154	CCACCACAAGACAAGACAAGAATG 	CCTGATCGATCTCATCGTCGT    	
BMC 1016	GTGATACCGGGTAATCTGGTGC   	GATGATGGGTGATCATCGGTTC   	
BMC 1023	CTTGTGCCACCACATGCAGTA    	CAGTTTGGAACAGGGAAAAGTACG 	
BMC 1655	ACGCAAGTACAAAATTACTGCGGA	ATTAACGGCATGCTTGTAGCCTAA 	
BMC 1025	GCTCCACTTCCACCCTGATATG   	CGCTAATGTCCCCATTGATGAT   	
BMC 1091	TATTATGAGGAATGCTCCGGAAAG 	CCTTGCTTTTCTCCTTTATTTCTCC	
BMC 1237	AATTACCTGTGTTATTTGTGGGGA 	TCATGATTTTGAGTTCCTTGAACA 	
BMC 1564	AAGAAGAAAGAGAAGAAGCACGGG 	GGACAGCTCGTATTATAACCTGCG 	
BMC 1451	GGTAGATCGAGAAAGGAGTGGACA 	TTGCAAGAGCACACGACTAAGAAG 	
BMC 1347	AGTACATGGCTCTGTCCTTCCCTC 	CAGTCGTCGTCCAGCTCCAG     	
BMC 1252	GCGTCGGAGAAGTACATCAAGTTT 	CTTCTGCATCATCATCATCGTCTT 	

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos na eletroforese em gel de agarose permitiram observar que, dos 21 conjuntos de primers de milho apenas três conjuntos de primers mostraram eficiência na transposição dos SSRs (Figura 1). A hipótese é de que é possível verificar a existência de regiões homologas entre milho e arroz.Possivelmente os demais primers utilizados e que não amplificaram, não apresentem regiões similares do genoma. Resultados semelhantes foram obtidos por Nassi et al. (2005), que testaram 10 conjuntos de primers do arroz em trigo e obtiveram a amplificação de quatro deles.
Trabalhos posteriores incluem o alinhamento in silico do conjunto de primers, verificando o nível de identidade ou divergência entre as espécies. 

 M  1   2  3  4  5  6  7  8 9  10  11  12  13  14 15  16   17  18  19 20 21 

Figura 1- Gel de agarose com as amplificações, em DNA de arroz (Oryza sativa L.), de primers obtidos a partir de milho, FAEM/UFPel, 2006.

4.	CONCLUSÕES

Os resultados positivos de amplificação dos primers oriundos de milho em DNA de cloroplasto de arroz apresenta um determinado nível de similaridade entre as regiões (espécie origem e espécie transposta), acrescido da similaridade também encontrada nas demais espécies, apontando para a eficiência na transposição de marcadores SSRs entre espécies correlatas, pois, confirma a suposição de homologia e alto nível de conservação entre as regiões identificadas.
É possível utilizar marcadores microssatélites desenvolvidos a partir do genoma do milho em arroz. 

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABADIE, T.; CORDEIRO, C.M.T.; FONSECA, J.R.; ALVES, R.B.N.; BURLE, M.L.; BRONDANI, C.; RANGEL, P.H.N.; CASTRO, E.M.; SILVA, H.T.; FREIRE, M.S.; ZIMMERMANN, J.P. Construção de uma coleção nuclear de arroz para o Brasil. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, 129-136, 2005.

Morgante, M.; Olivieri, A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. The Plant Journal. jan. 1993, v.3,  n.1, p.175-182.

NASSI, F.L.; SANTOS, L.S. TURCHETTO, A.C.; ZANANDREA, I.; RIBEIRO, M.V.; BRAGA, E.J.B.; BONOW, S.; PETERS, J.A..Transferibilidade de primers para análise de locos microssatélites (SSR) entre arroz e trigo.  In: XIV CIC - CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2005, Pelotas. Anais... UFPel, 2005. 1CD-ROM.

SAGHAI-MAROOF, M. A.; SOLIMAN, K. M. ; JORGENSEN, R. A.; ALLARD, R. W. Ribosomal DNA spacer length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosome location and population dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 1984, v.89, p. 1477-1481.

ZIMMER, P. D., et al. Identification of rice mutants (Oryza sativa L.) for agronomical and root system traits. Revista Brasileira de Agrociência. v.9, p.195-199, 2003.