Listeria monocytogenes EM CARNE DE FRANGO: DETECÇÃO DE CÉLULAS INJURIADAS POR ALTAS PRESSÕES

JANTZEN, Márcia Monks; NAVAS, Jaime; da SILVA, Wladimir; DE PAZ, Máximo, RODRÍGUEZ Buenaventura; Nuñez, Manolo & Martínez-Suárez, Joaquín

1 Departo de Tecnologia de Alimentos, Insto Nacional de Investig. y Tecnologia Agraria y Alimentaria (INIA), Carretera de La Coruna km 7.5, 28040 Madri, Espanha.
2 Departo de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, – FAEM/UFPel, Caixa Postal 354, Pelotas/RS, Brasil. mjantzen@ufpel.edu.br

1.	INTRODUÇÃO

A detecção de células viáveis de patógenos bacterianos que podem estar injuriadas após o processamento dos alimentos é essencial para a segurança alimentar (Ryser e Marth, 1999). A maioria dos meios de cultivo recomendados para o isolamento de L. monocytogenes injuriada subletalmente não possui nenhum grau de seletividade pois os agentes seletivos inibem a recuperação das células injuriadas (Donnelly, 2002). Poucas tentativas foram realizadas para desenvolver meios seletivos e diferenciais para o isolamento de células de Listeria injuriada subletalmente a partir de alimentos comtaminados (Kang e Fung, 1999; Wu et al., 2001). Métodos mais simples e mais efetivos para a recuperação de patógenos de origem alimentar submetidos a estresse, a partir de alimentos contaminados, são necessários. Além disso, os agentes seletivos deveriam ser diferenciais para L. monocytogenes ou Listeria spp. patogênica. 
O Agar Listeria acording to Ottaviani and Agosti (ALOA), desenvolvido primeiramente como um meio seletivo e diferencial para L. monocytogenes (Ottaviani et al., 1997), tem apresentado uma eficiente recuperação de células de Listeria injuriadas subletalmente (Vlaemynck et al., 2000). Nas placas de ALOA todas as Listeria spp. produzem colônias de coloração violeta-azulada, e L. monocytogenes e L. ivanovii aparecem rodeadas por uma zona de precipitação visualizada com um halo opaco diferencial (Reissbrodt, 2004). O objtivo no presente trabalho foi pesquisar um novo método para quantificar L. moncocytogenes injuriada subletalmente por aplicação de altas pressões em carne de frango. 

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Utilizou-se como inóculo cepas EGD-e (Glaser et al., 2001) de L. monocytogenes do sorotipo 1/2a. Carne comercial moída foi comparada com peito de frango cru artificialmente contaminado. As amostras artificialmente contaminadas foram testadas quanto à ausência de Listeria spp. pelo pelo procedimento USDA-FSIS (http://fsis.usda.gov/Ophs/Microlab/Mig_8_4.pdf, acessado em 01/02/06) 
As amostras de frango foram inoculadas com L. monocytogenes a uma concentração final de aproximadamente 105 UFC.g-1. Alíquotas de 25g de carne de frango moída e inoculada foram embaladas a vácuo e mantidas a 40C até o momento da pressurização. O tratamento com altas pressões foi realizado no Instituto Nacional de Ciéncia y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), que possui um processador hidrostático para alimentos (ACB, Nantes, France). Para testar o poder de injúria subletal das altas pressões sobre L. monocytogenes em carne de frango, a cinética de inativação sob diferentes condições e em diferentes tipos de amostras foram examinadas. As amostras foram tratadas a partir de 200 a 400 Mega Pascal (MPa) – ou 2000 a 4000 Atm -  a uma temperatura constante de 120C por 2 a 15 min e a pressão mais alta foi estabelecida para ser utilizada. 
Cada amostra tratada por altas pressões e amostras-controle não tratadas foram assepticamente processadas e homogeneizadas em caldo UVM base (University of Vermont Broth modificado, sem suplemento antimicrobiano). Antes e após os diferentes períodos de incubação (3,6,9 e 24 h) a 300C para a recuperação celular, L. monocytogenes foi quantificada em duplicata em ágar ALOA e em ágar ALOA-S. As colônias típicas de L. monocytogenes em ALOA foram contadas após 48h (ALOA) ou após 72h (ALOA-S), a 370C. A recuperação das células durante a incubação em caldo não-seletivo foi analisada pela técnica de plaqueamento diferencial (Beuchat et al., 1986; Smith e Archer, 1988) com ALOA representando o ágar não-seletivo, e ALOA suplementado com 4 % de NaCl (ALOA-S), como o meio seletivo para células não injuriadas. A presença e o desenvolvimento da microbiota acompanhante presente na carne de frango foi detectada em Agar Soja Triptona com Extrato de levedura (TSYEA) antes da pressurização e durante os diferentes tempos de recuperação celular. 
Para comparar a recuperação de L. monocytogenes em ALOA ou em ALOA-S após 0 e 6 horas, a média da população celular de três ensaios foram gravados e convertidos em valores logaritmicos (log10) para determinar a diferença significativa (P<0,05) pelo teste T-Student. 

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Pressões menores do que 400  MPa apresentaram baixo efeito sobre a inativação de L. monocytogenes. De acordo com as diferenças na composição das amostras, em carne comercial (78% de carne de frango e 22% de gordura) e amostras sem gordura de carne de frango moída, os tempos de inativação foram diferentes. A 400 MPa e 120C houve uma inativação de 1 ciclo logarítmico a cada 3,29min (valor D) com a amostra de carne comercial, e a cada 1,41min com a carne pura de frango (dados não demonstrados).  Após 3,5 min de tratamento, a pressão sob essas condições geralmente foi suficiente para alcançar uma inativação logarítmica de >2 log10 na carne pura moída de frango (Figura 1). Para uma melhor repetibilidade, os experimentos subseqüentes foram desenvolvidos com a carne pura moída de frango.
O número de células nos caldos de enriquecimento contendo a carne de frango não-tratada aumentou mais do que 1 log10 em 6h de incubação, entretanto, nas amostras tratadas não houve aumento no número de sobreviventes antes de 6h. As contagens de Mesófilos Aeróbios Facultativos em TSYEA, revelou que a microbiota inicial variava de 2 x 103 a 1 x 104 UFC.mL-1 e após 6 horas de incubação em UVM base esse número aumentava para 106 UFM.mL-1 até 107 UFC.mL-1. No caso de amostras tratadas, o ALOA recuperou o mesmo número de células as 0h e após 6h de enriquecimento não-seletivo (Figura 1 eTabela 1). Se as células injuriadas não crescessem em ALOA, como na maioria dos meios seletivos, o número de colônias em ALOA aumentaria durante o enriquecimento em razão do reparo da injúria. Com isso, concluiu-se que o ALOA permitiu a recuperação da maioria das células bacterianas injuriadas apesar de seu suplemento seletivo. 

Reparo (h)

Injúria (min)

Fig. 1 Comparação da recuperação de L. monocytogenes com o ALOA (○) e o ALOA-S (●) após o tratamento com alta pressão por 3,5min (400 MPa/120C) e após enriquecimento em caldo não-seletivo (UVM) por até 24h.
Nas amostras não tratadas, a diferença na recuperação de L. monocytogenes em ALOA, e em ALOA-S, não foi significativa (P>0,05), porém em amostras tratadas, a recuperação de L. monocytogenes em ALOA foi significantivamente mais alta do que em ALOA-S (P<0,05). Farkas et al. (2003) demonstraram que L. monocytogenes injuriada por altas pressões apresentou um aumento de sensibilidade ao sal. Ao suplementarem ágar BHI com 5% de NaCl, Farkas et al. (2003) observaram que não houve influência na recuperação de células não-pressurizadas, porém populações residuais de células tratadas foram reduzidas em vários ciclos logarítmicos quando o meio de cultivo utilizado continha NaCl.
TABELA 1: Recuperação de Listeria monocytogenes a partir de amostras tratadas e controles não-tratados com dois meios de cultivo, antes e após 6h de enriquecimento.
	log10 UFC mL-1  *	
	0 h	6 h	
Amostras	ALOA	ALOA-S	ALOA	ALOA-S	
Não-Tratadas 	4,93 ± 0,31b	4,80 ± 0,32b	6,59 ± 0,22a	6,24 ± 0,22a	
Tratadas 	3,62 ± 0,60c	0.00e	3,85 ± 0,62c	2,58 ± 0,39d	
* Os dados representam a média ± SD de três medidas antes ou após o tratamento (400 MPa e 12ºC por 2,5 min). Em cada célula, os valores seguidos por letras diferentes são estatisticamente diferentes (P<0.05).
Antes da incubação no caldo (tempo zero), mais de 99% das células estavam injuriadas e não cresceram em ALOA-S; durante a recuperação (amostras de 3 e 6h), as UFC obtidas em ALOA-S alcançaram as obtidas em ALOA e, após 9 h, foram similares (Figura 1). A habilidade do Agar Listeria According to Ottaviani and Agosti (ALOA) para recuperar eficientemente L. monocytognes injuriadas subletalmente pode ser muito útil para a quantificação direta de células injuriadas em certos tipos de alimentos processados (como por altas pressões) e inclusive a partir de uma matriz alimentar contendo diferentes organismos. 

4. CONCLUSÕES

No presente trabalho foi demonstrado que o ALOA e o ALOA-S podem ser utilizados como meio de plaqueamento diferencial para a quantificação de células injuriadas de Listeria a partir de alimentos processados. As células de L. monocytogenes injuriadas subletalmente por altas pressões podem ser enumeradas por plaqueamento direto em ALOA contendo um nível de contaminação por Listeria acima da sensibilidade da técnica de plaqueamento direto (>100 UFC.g-1).

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BEUCHAT L.R., BRACKETT, R.E., HAO, D.Y. & CONNER, D.E. Growth and thermal inactivation of Listeria monocytogenes in cabbage and cabbage juice. Canadian Journal of Microbiology, 1986, v. 32, pp. 791-795. 
DONNELLY, C.W. Detection and isolation of Listeria monocytogenes from food samples: implications of sublethal injury. Journal AOAC International, 2002, v. 85, pp. 495-500. 
FARKAS, J., ANDRASSY, E., MESZAROS, L. & SIMON, A. Increased salt- and nisin-sensitivity of pressure-injured bioluminescent Listeria monocytogenes. Acta Microbiol Immunol Hung, 2003, v. 50, pp. 331-337.  
GLASER, P., FRANGEUL, L., BUCHRIESER, C. et al. Comparative genomics of Listeria species. Science, 2001, v. 294, pp. 849-852.  
Smith, I.L., Archer, D.L. Heat-induced injury in Listeria monocytogenes. J Ind Microbiol. 1988, v. 3, pp. 105-110. 
KANG, D.H. & FUNG, D.Y. (1999) Thin agar layer method for recovery of heat-injured Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection,1999, v.62, pp. 1346-1349. 
OTTAVIANI, F., OTTAVIANI, M. & AGOSTI, M. Esperienza su un agar selettivo e differentiale per Listeria monocytogenes. Industria  Alimentaria,  1997, v.36: 888-8951. 
REISSBRODT, R. New chromogenic plating media for detection and enumeration of pathogenic Listeria spp.--an overview. International Journal of Food Microbiology, 2004, v. 95, pp. 1-9.  
RYSER, E.T. & Marth, E.H. Listeria, listeriosis and food safety. Marcel Dekker Incorporation, 1999, New York. 
USDA, 2002. Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat, poultry, egg and environmental samples, revision 03, April 29, 2002. In: Microbiology Laboratory Guidebook [on line]. Available in http://www.fsis.usda.gov/OPHS/microlab/mlgbook.htm, MLG 8.03 pp 1–20 [1 February, 2006]. 
VLAEMYNCK, G., LAFARGE, V. & SCOTTER, S. Improvement of the detection of Listeria monocytogenes by the application of ALOA, a diagnostic, chromogenic isolation medium. Journal of Applied Microbiology, 2000, v.  88, pp. 430-441. 
WU, V.C., FUNG, D.Y., KANG, D.H. & THOMPSON, L.K. Evaluation of thin agar layer method for recovery of acid-injured foodborne pathogens. Journal of Food Protection, 2001, v. 64, pp. 1067-1071.