Desinfestação de Explantes de Cerejeira-do-rio-grande (Eugenia involucrata DC.) Visando o Estabelecimento de Plantas In vitro 

RIBEIRO, mirian de Farias1; SOUZA, Joseane Almeida de1; DONINI, Lorena Pastorini1; SOARES, Gustavo Campos1; SCHUCH, Márcia Wulff1

1Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas, Deptº de Fitotecnia – FAEM/UFPel 
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. mirianpelotas@yahoo.com.br

1. INTRODUÇÃO

No Sul do Brasil existe uma grande diversidade de fruteiras nativas, dentre as quais se destaca a cerejeira-do-rio-grande.
A cerejeira (Eugenia involucrata DC.) pertencente a família Myrtaceae, é vulgarmente conhecida como cereja, cereja-do-mato e cereja-do-rio-grande. É uma excelente frutífera nativa que não deve ser confundida com as cerejeiras européia e japonesa, que pertencem a família das rosáceas, nem com a cerejeira do Norte do Brasil, que é uma espécie madeireira. A cerejeira do Sul do Brasil é uma árvore com flores brancas e frutos grandes de cor vermelha a cor de vinho, saborosos, usados na alimentação humana. É uma planta cultivada como ornamental e frutífera. Sua madeira pesada é usada em construção civil e cabos de ferramentas. Seus frutos são comercializados na forma de doces, geléias e licores (BACKES & IRGANG, 2002).
A propagação pode ser por estaquia e sementes, sendo a segunda forma a mais recomendada por Sanchotene (1989). O cultivo in vitro é um método viável para propagação de diversas espécies frutíferas, podendo ser utilizado também com as espécies nativas proporcionando a produção de mudas com alta sanidade, além de acelerar os métodos de propagação convencional.
As plantas lenhosas, onde se inclui a maioria das frutíferas, apresentam dificuldades relevantes para o estabelecimento in vitro, principalmente devido a contaminação e oxidação. Para evitar ou amenizar a contaminação, são determinantes os pré-tratamentos aplicados na planta doadora do material vegetal utilizado para isolamento in vitro. A primeira medida é a manutenção da planta-matriz em ambiente higienizado, como casa de vegetação ou câmara de crescimento, evitando desta forma sua exposição às intempéries, insetos que provocam ferimentos e a entrada de microrganismos. Substâncias com ação bactericida, fungicida e inseticida podem ser utlizadas antes do estabelecimento in vitro. Durante o estabelecimento in vitro, várias substâncias com ação germicida podem ser utilizadas para a desinfestação dos explantes. Os mais comuns são o etanol e os compostos a base de cloro, tais como o hipoclorito de sódio e o de cálcio (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Este trabalho teve como objetivo controlar a contaminação in vitro utilizando diferentes concentrações de hipoclorito de sódio e cálcio em diferentes tempos, visando o estabelecimento dos explantes de cerejeira-do-rio-grande. 

2. MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas, Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, da Universidade Federal de Pelotas, RS. 
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com quatro repetições por tratamento. Cada repetição constituiu-se de cinco tubos de ensaio com um explante. 
O explante constituiu-se de segmento nodal extraído de material cultivado em casa de vegetação. Visando diminuir a contaminação in vitro, as mudas foram pulverizadas semanalmente (1 ou 2 aplicações semanais), com antibiótico do tipo Estreptomicina e fungicida Cercobin® nas doses de 2,4 g L-1 e 0,7 g L-1, respectivamente.
Na coleta do material, os ramos herbáceos, obtidos de brotações novas, foram cortados com comprimento de aproximadamente 20 cm e levados até o laboratório, após foi feito toalete, segmentando-os e eliminando-se as folhas na altura do pecíolo, sendo em seguida os segmentos desinfestados em câmara de fluxo laminar onde o material foi colocado em álcool 70% por 60 segundos e após, lavados em água esterilizada, seguindo pela imersão em uma solução de hipoclorito de sódio (2,5 e 5%) e uma solução de hipoclorito de cálcio (2,5 e 5%), adicionada de 1 gota de Tween 20, pelo período de 10, 15 e 20 minutos e após lavados por três vezes em água esterilizada. 
Segmentos nodais contendo uma gema foram inoculados em meio de cultura WPM (LLOYD & McCOWN, 1980) sumplementado com 0,1 g L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose e solidificado com ágar na concentração de 6 g L-1. O pH foi ajustado para 5,8 antes da inclusão do solidificante (ágar) e, posteriormente, o meio foi autoclavado a 121ºC e 1,5atm por 20 minutos. Foram utilizados tubos de ensaio com 6 mL de meio de cultura. 
Os explantes foram mantidos no escuro por um período de sete dias, visando diminuir a oxidação fenólica. Após este período realizou-se a avaliação quanto à percentagem de explantes contaminados. Os explantes foram transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25  2ºC e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27molm-2s-1. Mais duas avaliações também foram realizadas aos 14 e 40 dias.
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan a 5% de signifcância. Os dados em percentagem foram transformados em arco seno da raiz quadrada de x/100, onde x é o percentual obtido.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para a variável percentagem de contaminação fúngica os tratamentos utilizados não apresentaram diferença estatística, observando-se uma média de 11,08% que não influenciou no estabelecimento in vitro de cerejeira. Já para a variável percentagem de contaminação bacteriana, observou-se interação entre o tipo de hipoclorito, concentração utilizada e tempo de exposição dos explantes. Explantes tratados com hipoclorito de cálcio quando utilizado na concentração de 5% por 10 minutos, não apresentaram contaminação fúngica, assim como na concentração de 2,5% por 15 minutos de exposição. Explantes tratados com hipoclorito de sódio não apresentaram contaminação quando utilizada a concentração de 5% por 20 minutos, não diferindo dos demais (Tabela 1). Em trabalho sobre desinfestação de explantes de mirtilo, Vicenzi et al. (2002), a contaminação bacteriana, avaliada aos 50 dias, foi praticamente nula, alcançando uma média de 0,42%. No estabelecimento in vitro de cultivares de macieira utilizando hipoclorito de sódio e hipoclorito de cálcio, Erig & Schuch (2003), a contaminação fúngica ocorreu em percentagens baixas (de 0,1 a 18,4%). Nas cvs. Maxigala e Galaxy, a contaminação foi superior quando se utilizou hipoclorito de cálcio.

Tabela 1: Percentagem de contaminação bacteriana aos 40 dias de cultivo in vitro de cerejeira-do-rio-grande, em função do tipo de hipoclorito, concentração utilizada e tempo de exposição dos explantes.
Hipoclorito		Tempo	
		10		15		20	
		Concentração de hipoclorito	
		2,5	5,0		2,5	5,0		2,5	5,0	
Cálcio		60,5 a A	0,00 a B		0,00 a B	29,5 a A		8,10 a A	29,5 a A	
Sódio		11,7 b A	1,40 a A		8,14 a A	11,7 a A		1,38 a A	0,00 b A	
Médias seguidas de mesma letra minúsculas nas colunas, e maiúsculas nas linhas não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5% de significãncia.

A percentagem de sobrevivência e estabelecimento dos explantes de cerejeira foi alta (63,86% e 54,05%, respectivamente). Para a variável percentagem de sobrevivência houve influência do tipo de hipoclorito, verificando-se maior sobrevivência com a utilização de hipoclorito de sódio (87,3%) e menor com hipoclorito de cálcio (72,9%). Embora Erig & Schuch (2003) tenham obtido maior percentagem de sobrevivência dos explantes de macieira quando utilizado hipoclorito de sódio em comparação com hipoclorito de cálcio (15,5% e 6,7%, respectivamente), este resultado é muito inferior a percentagem de sobrevivência dos explantes de cerejeira. Houve também influência da interação entre concentração de hipoclorito e tempo de exposição, observando-se maior percentagem de sobrevivência no tempo de 10 minutos na concentração de 5%, já na concentração de 2,5% necessita ser utilizado um tempo maior (15 minutos) (Tabela 2).  

Tabela 2: Percentagem de sobrevivência aos 40 dias de cultivo in vitro de cerejeira, em função da concentração de hipoclorito e tempo de exposição dos explantes.
Concentração de hipoclorito	Tempo (minuto)	
	10	15	20	
2,5	71,2 b B	95,9 a A	77,9 a B	
5,0	90,7 a A	68,2 b B	70,9 a B	
Médias seguidas de mesma letra minúsculas nas colunas, e maiúsculas nas linhas não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5% de significância.

Para variável percentagem de estabelecimento, houve influência da interação tipo de hipoclorito e tempo de exposição e da interação concentração utilizada e tempo de exposição (Tabela 3). Erig & Schuch (2003) observaram uma percentagem de estabelecimento extremamente baixa, com uma média de 2,2% aos 45 dias de cultivo in vitro, sendo muito inferior a percetagem de estabelecimento dos explantes de cerejeira.

Tabela 3: Percentagem de estabelecimento aos 40 dias de cultivo in vitro de cerejeira-do-rio-grande, em função do tipo de hipoclorito e tempo de exposição e concentração de hipoclorito e tempo de exposição.
Hipoclorito	Tempo	
	10	15	20	
Cálcio	52,5 b B	80,6 a A	62,9 a AB	
Sódio	80,6 a A	55,8 b B	57,5 a AB	
Concentração de hipoclorito	Tempo	
	10	15	20	
2,5	55,3 a B	83,1 a A	67,9 a AB	
5,0	78,4 a  A	52,1 b B	52,2 a B	
Médias seguidas de mesma letra minúsculas nas colunas, e maiúsculas nas linhas não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5% de significância.

4. CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos conclui-se que para evitar a contaminação in vitro de explantes de cerejeira-do-rio-grande durante o estabelecimento, recomenda-se o uso de hipoclorito de sódio na concentração de 5% durante 10 minutos, o qual reduz a taxa de contaminação e aumenta a percentagem de sobrevivência e estabelecimento.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BACKES, A; IRGANG, B. Árvores do Sul: guia de identificação e interesse ecológico. Porto Alegre: Pallotti, 2002, p. 275.
ERIG, A.C. & SCHUCH, M.W. Tipo de explante e controle da contaminação e oxidação no estabelecimento in vitro de plantas de macieira (Malus domesticaBORKH.) cvs. Galaxy, Maxigala e Mastergala. Revista Brasileira de Agrociência. Pelotas, 2003, 9, n. 3, p. 221-227.
GRATTAPAG LIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: SPI /Embrapa - CNPH, 1998, 1, p. 183-260.
LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Combined Proceedings of International Plant Propagators’ Society, Seattle, 1980, 30, p. 421-427.
SANCHOTENE, M.C.C. Frutíferas nativas úteis na arborização urbana. 2ed. Porto Alegre: SAGRA, 1989, p. 158-163.
VICENZI, M.; CHAVES, A.C.; ERIG, A.C.; SCHUCH, M.W. & FACHINELLO, J.C. Desinfestação de Explantes de Mirtilo (Vaccinium Ashei Reade) Visando o Estabelecimento de Plantas In Vitro. Anais do XVII Congresso Brasileiro de Fruticultura. Belém, 2002.