OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA DE RT-PCR PARA ESTUDO DA EXPRESSÃO DE mRNAs DE POLIGALACTURONASES E PECTIL METIL ESTERASES EM PÊSSEGOS 'CHIRIPÁ'
PEGORARO, Camila1; DAL CERO, Joceani1; FERRAREZE, Jocleita Peruzzo2; BORSUK, Sibele3; ZANUZO, Marcio Roggia3; SILVA, Jorge Adolfo4
1-Acadêmica de Agronomia do 8° semestre, bolsista de iniciação científica; 2-Mestranda, 3-Doutorando, 4- Professor Adjunto, orientador

INTRODUÇÃO
 	A cultivar de pêssegos de polpa fundente mais cultivada no Sul do Brasil é ‘Chiripá’, em função da boa produtividade, ser de ciclo médio-tardio, e produzir frutas com bom sabor adocicado. De modo geral, a colheita é realizada no final de dezembro ou início de janeiro, dependendo da região de produção. Nesse período, na última safra (2005/2006), o preço médio pago aos produtores foi de R$ 1,20/kg. Já, no final de fevereiro, essa fruta obteve valores de comercialização de R$ 2,50. Evidentemente, essa situação só foi válida para os produtores que dispuseram de estrutura para armazenamento. No Brasil o sistema de armazenamento ainda mais empregado é o uso de ar refrigerado com temperaturas de 0oC±0,5oC e umidade relativa entre 92 e 95%. Nessa condição, se as frutas forem colhidas no estádio de maturação denominado verdoengo, o armazenamento seguro é de aproximadamente 20 dias. Se esse período for prolongado, há uma significativa ocorrência de lanosidade, podendo atingir 100% das frutas. O emprego de atmosfera controlada, na qual, além do controle da temperatura e umidade relativa, se reduz a concentração de O2 para 2KPa e aumenta-se a de CO2 para 8KPa, pode prolongar o armazenamento para 25 a 40 dias (Brackmann et. al., 2003; Rombaldi et. al., 2003).
	A lanosidade é um distúrbio fisiológico que resulta na perda de suculência das frutas, sem, no entanto, haver redução do teor de água (Zhou et al., 2000a). Essa alteração tem sido associada a alterações dos padrões normais de atividades de enzimas hidrolíticas, em especial as poligactorunases (PG) e pectina metil esterase (PE), sob a regulação de expansinas (EXP) (Zhou et al.,2000b e Zhou et al., 2001). Porém, acredita-se que a atmosfera controlada seja capaz de inibir, de forma equilibrada, a expressão dos genes das PGs e das PEs, enquanto o armazenamento refrigerado é mais eficiente no controle das PGs do que das PEs. Nesse contexto, busca-se estudar o efeito da AC na transcrição da PG, PE e da EXP, bem como do gene da fração ribossomal 18S(controle positivo). 
MATERIAL E MÉTODOS
	Foram utilizados pêssegos 'Chiripá', safra 2005/2006, provenientes de pomar comercial do município de Farroupilha-RS. A colheita foi realizada em 06/01/2006 e o transporte até as câmaras frias foi realizado sem refrigeração. O tempo decorrido entre a colheita e o armazenamento foi de 4,5 horas.
Os tratamentos aplicados foram: T1 - atmosfera refrigerada (AR); T2 - atmosfera controlada (AC) 1KPa de O2 e 3KPa de CO2 (1/3); e, T3 - AC 2KPa de O2 e 8KPa de CO2 2/8. As análises foram realizadas após 25 e 40 dias de armazenamento em AC e em AR.
A variável monitorada para avaliar os tratamentos foi a expressão de mRNAs da PG, PE, EXP e da fração ribossomal 18S, pela técnica de RT-PCR. Essa técnica inclui a extração de RNA, seguida de digestão com DNAse I e uma posterior síntese de cDNAs. A amplificação foi conduzida utilizando-se oligonucleotídeos específicos para os clones da PG, da PE, da EXP e da fração 18S de pêssegos (disponíveis NCBI), sob as condições de PCR: desnaturação inicial: 95°C por 5 min, desnaturação: 95°C por 1,5 mim, anelamento: 49°C por 1 mim, extensão: 72°C por 1,5 min e extensão final:72°C por 10 min, sendo desnaturação, anelamento e extensão repetidas por 37 vezes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
	Ao analisarem-se os resultados da Figura 1, observa-se que, em todas as amostras, foi possível detectar a expressão de mRNAs do gene da fração ribossomal 18S. Isso já era esperado, pois trata-se de gene constitutivo, cuja expressão está associada ao processo de tradução protéica, no qual a fração 18S faz parte da estrutura dos ribossomas de eucariotos. No entanto, era esperado que a intensidade das bandas fosse semelhante, por ser um gene constitutivo e não ter sua expressão estimulada ou reprimida por fatores bióticos ou abióticos. Isso não ocorreu. A hipótese mais provável para esse impasse é que ainda não está totalmente otimizada a condição de extração e dosagem da concentração de RNAs neste trabalho.

 M      1    2     3      4     5     6

M-Marcador de Peso Molecular
DNA fago /Hind III
1-AR 25 dias
2-AC 1/3 25 dias
3-AC 2/8 25 dias
4-AR 40 dias
5-AC 1/3 40 dias
6-AC 2/8 40 dias

Figura 1 - Expressão de mRNAs, por RT-PCR, da fração ribossomal 18S de pêssegos 'Chiripá' armazenados em atmosfera refrigerada (AR) e atmosfera controlada (AC).

             Ao calibrarem-se as condições de estudo da expressão de mRNAs de PG, PE e EXP nesses pêssegos, em 6 repetições do mesmo tratamento, os resultados não foram totalmente concordantes, o que é visível na figura 2.
	Assim por exemplo, observa-se, na primeira repetição, amplificaram-se as reações com a EXP, mas não houve amplificação com PG, nem com PE e do controle constitutivo 18S. Isso significa que ainda há problemas na otimização, pois é obrigatória a presença de mRNAs da fração 18S. Esse mesmo problema se repetiu no quarto, quinto e sexto ensaios. Nesses casos, entretanto, detectou-se leve expressão da PE, até então não detectada. A fração mRNA 18S somente foi detectada nos ensaios 2 e 3. Desse modo, há necessidade de vista de otimização da técnica de extração, preparo e quantificação dos cDNAs, bem como revisar dados referentes à eficiência ou não de 18S como controle. Embora não estejam apresentados os demais resultados, também se verificou que essa desuniformidade ocorreu em pêssegos armazenados em AC.

	O porquê da não reprodutibilidade dos resultados não está esclarecida. Como hipóteses, incluem-se aspectos relacionados a coleta do tecido dos frutos, a extração de mRNAs e preparo dos cDNAs. Por isso, se está projetando, para a próxima safra, nova instalação do experimento e realização de novos testes, incluindo alterações na técnica de RT-PCR.

Figura 2 - Expressão de mRNAs de PG, de PE, de EXP e de 18S, por RT-PCR, em pêssegos 'Chiripá' armazenados em atmosfera refrigerada (AR) durante 25 dias. Ensaio 1: cDNA 2A, Ensaio 2: cDNA 2A’   , Ensaio 3: cDNA 3, Ensaio 4: cDNA 4, Ensaio 5: cDNA 4’ e Ensaio 6: cDNA 5.

CONCLUSÃO
	Não foi possível testar a hipótese, tendo em vista a não reprodutibilidade dos resultados frente às repetições dos tratamentos e das análises.

AGRADECIMENTOS
	Ao CNPq, pelas bolsas e auxílio à pesquisa e à CAPES, pela bolsa de estudos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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BRACKMANN, A.; STEFFENS, C.A.; GIEHL, R.F.H.R. Armazenamento de pêssego ‘Chimarrita’ em atmosfera controlada e sob absorção de etileno. Ciência Rural, 33(3):431-435, 2003.
ROMBALDI, C.V.; SILVA, J.A.; MACHADO, L.B.; PARUSSOLO, LUCCCHETTA, L.; ZANUZO, M.R.; GIRARDI, C.L.; CANTILANO, R.F. Storage of ‘Chiripá peach in controlled atmosphere. Ciência Rural, 31:43-47, 2003.
ZHOU, H.W., BEN-ARIE, R., LURIE, S. Pectin esterase, polygalacturonase and gel formation in peach pectin fractions. Phytochemistry. 55, 191-195, 2000a
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ZHOU, H.W., DONG, L., BEN-ARIE, R., LURIE, S.,. The role of ethylene in the prevention of chilling injury in nectarines. J. Plant Physiol. 158, 55-61,2001