AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DE CÉLULAS MERISTEMÁTICAS DE SOJA TRANSGÊNICA E CONVENCIONAL TRATADAS COM GLIFOSATO
TIMM, Fabiana Carrett1*, BERVALD, Clauber Mateus Priebe2, RIBEIRO, Samuel Gonçalves1, BENDER, Ana Elisa Nunes1, GARCIAS, Gilberto de Lima1, MARTINO-ROTH, Maria da Graça1, MORAES, Dario Munt de2

1Laboratório de Genética, 1*Bolsista BIC-UCPEL                                                                                                                                     –Escola de Medicina –UCPel;
2Laboratório de Fisiologia de Sementes – DB – IB/UFPel;
Félix da Cunha– Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. fabixtimm@pop.com.br

1.	INTRODUÇÃO

A biotecnologia vem se constituindo numa importante ferramenta para o desenvolvimento de novas variedades de plantas e para o estudo da genética dos mais diferentes organismos. Os primeiros resultados proporcionados à agricultura pela biotecnologia começaram a aparecer nos Estados Unidos, em 1995. A soja Rondap Ready (RR) é um transgênico que recebeu, por meio de técnicas da biotecnologia, um gene de um outro organismo capaz de torná-la tolerante ao uso de um tipo de herbicida, o glifosato [1]. 
O glifosato é um herbicida pós-emergente, pertencente ao grupo químico das glicinas substituídas, classificado como não-seletivo e de ação sistêmica. Apresenta largo espectro de ação, o que possibilita um excelente controle de plantas daninhas anuais ou perenes, tanto de folhas largas como estreitas. Ele atua como um potente inibidor da atividade da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), que é catalisadora de uma das reações de síntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano. Influencia também outros processos, como a inibição da síntese de clorofila, estimula a produção de etileno, reduz a síntese de proteínas e eleva a concentração do ácido indol-3-acético (AIA) [ 2, 3].
O uso comercial de plantas transgênicas tem sido alvo de um grande debate mundial, onde posições acirradas são apresentadas tanto a favor, quanto contra as plantas modificadas geneticamente. São discussões que levantam questões importantes como a forma que um gene introduzido modifica o metabolismo da planta e como essa planta pode ou não alterar o meio ambiente, a saúde humana e animal [4]. É necessário apurar possíveis danos dos transgênicos na saúde e na cadeia produtiva da soja.
A citotoxicidade de substâncias é avaliada pelo surgimento de alterações no processo de divisão celular sobre o organismo teste, tanto pela inibição do índice mitótico como pela incidência de mutações cromossômicas, como, quebras cromatídicas, perda de cromossomos inteiros ou a formação de micronúcleos assim como alterações interfásicas que podem surgir sob a forma de micronúcleos, brotos nucleares, células binucleadas e com núcleos ligados. 
O micronúcleo se constitui em uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do núcleo principal. Os micronúcleos são formados durante a telófase da mitose ou meiose, quando o envelope nuclear é reconstituído ao redor dos cromossomos das células filhas. São resultantes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou de cromossomos inteiros que não foram incluídos no núcleo principal. Assim sendo, o micronúcleo representa perda de cromatina em consequência de dano cromossômico estrutural (fragmento) ou dano no aparelho mitótico. É importante ressaltar que os micronúcleos são formados durante a mitose, independentemente do tipo de dano ocorrido durante o ciclo. Por isso, os danos no DNA causados, por exemplo, pela exposição a agentes mutagênicos, somente são expressos em micronúcleos após um ciclo de divisão celular, sendo dependentes da proporção de células que estão se dividindo. [7]
O objetivo deste estudo foi avaliar as anomalias interfásicas e do ciclo mitótico em células meristemáticas de soja transgênica cultivar (cv). CD 212 RR e convencional cv. CD 216, tratadas com diferentes concentrações do herbicida glifosato.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi realizado no Laboratório Didático de Análise de Sementes “Prof. Flávio Rocha” do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel (FAEM), UFPEL e no Laboratório de Genética, Escola de Medicina, UCPEL. 
Foram utilizadas sementes de soja convencional e transgênica, cultivar CD 216 e CD 212RR, respectivamente, que foram tratadas por meia hora em soluções crescentes do herbicida glifosato: zero; 1,8; 3,6; 5,2 e 7,0 g/L de equivalente ácido (e.a) e, submetidas ao teste de germinação, com uma amostra de 50 sementes em uma das quatro repetições. A semeadura foi realizada sobre papel germitest [5]. Foram coletadas as radículas dos organismos testes no terceiro dia e fixadas em Carnoy (3:1, etanol: ácido acético) por um período de 24 horas à temperatura de 4ºC e após transferidas para etanol 70%. Para a determinação do índice mitótico foi empregada a técnica de esmagamento [6]. A preparação do material para posterior análise do índice mitótico (IM), anomalias do ciclo mitótico (ACM), anomalias interfásicas (AI) e total de anomalias (TA). Foi realizada na seguinte ordem: lavadas três vezes em: água destilada, colocadas em HCl 5N por 10 minutos, lavadas 3 vezes novamente e colocadas em água destilada por cinco minutos à temperatura ambiente. Após as radículas foram transferidas para lâmina onde em microscópio esteroscópico foi retirada a coifa para a obtenção do meristema apical, adicionada orceína acética 2%, colocada uma lamínula sobre o material esmagado, e posteriormente aquecida. As lâminas das células de soja foram observadas em microscópio óptico a uma magnitude de 400x e 1000x. Os dados obtidos foram armazenados em um banco de dados do programa SPSS, “for Windows,” versão 10.0 e analisadas através do teste de Mann- Whitney U, sendo consideradas significativas as diferenças a nível de p < 0,05. 

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Comparando, a média da soja transgênica e convencional (Tabela 1 e Tabela 2) quanto ao número de células em divisão os tratamentos 3,6 e 5,2 g/L-1 de e.a. do herbicida diferiram entre si, sendo que a soja transgênica apresentou uma média do número de células em divisão ( 127,75 + 29,71 e 129,75 + 69,34, respectivamente) maior do que a média observada na soja convencional (62,25 + 17,87 e 32,00 + 28,31, respectivamente) (p= 0,021 e p= 0,043). Quanto ao número médio de ACM as duas cultivares diferiram entre si. A soja transgênica apresentou 3,25 + 2,75 e 3,75 + 2,06 nos tratamentos intermediários de 3,6 e 5,2 g/L de e.a. do herbicida, significativamente diferente da soja convencional, que não apresentou nenhuma alteração. A soja transgênica apresentou, no tratamento controle, bem como na dosagem mais baixa (1,8 g/L) uma média maior de AI (4,00 + 2,8) e TA ( 8,0 + 2,4) do que a soja convencional (1,00 + 0,81 e 1,75 + 1,25) (p= 0,037 e p= 0,020), respectivamente. 

Tabela 1. Média e desvio padrão do número de células em divisão celular, índice mitótico, anomalias do ciclo mitótico, anomalias interfásicas e total de anomalias em células meristemáticas de ápices de raízes de soja convencional CD 216.
Tratamentos
g/L-1	Nº de CD	IM
	ACM	AI	TA	
	X/DP		X/DP	X/DP	X/DP	
controle	184,00 + 61,84	18,59	0,75 + 0,95	1,00 + 0,81	1,75+ 1,25	
1,8	135,50 + 56,75	13,54	0,25 + 0,50	0,50 + 0,57	0,75 + 0,95	
3,6	62,25 + 17,87	6,22	0	4,75 +2,21	4,75 + 2,21	
5,2	32,00 + 28,31	3,25	0	6,25 + 1,50	6,25 + 1,00	
7,0	77,55 + 14,10	7,77	0,25 + 0,50	8,00 + 4,69	8,25 + 5,05	

Tabela 2. Média e desvio padrão do número de células em divisão celular, índice mitótico, anomalias do ciclo mitótico, anomalias interfásicas e total de anomalias em células meristemáticas de ápices de raízes de soja transgênica CD 212RR.

Tratamentos
g/L-1	Nº de CD	IM
	ACM	AI	TA	
	X/DP		X/DP	X/DP	X/DP	
controle	141,50 + 21,14	14,15	4,00 + 3,55	4,00 + 2,8	8,0 + 2,94	
1,8	175,00 + 82,69	17,5	3,00 + 4,76	15,75 + 8,30	18,75 + 10,21	
3,6	127,75 + 29,71	12,77	3,25 + 2,75	6,25 + 3,77	9,50 + 3,69	
5,2	129,75 + 29,71	12,97	3,75 + 2,06	6,25 + 2,36	10,00 + 4,32	
7,0	70,50 + 37,50	7,05	0,50 + 0,57	5,75 + 4,64	6,25 + 5,12	
4. CONCLUSÕES

A soja convencional foi mais sensível ao efeito das diferentes dosagens do herbicida, em relação a soja transgênica, que já apresenta mais alterações constitutivas, entretanto, mais estudos são necessários para tomar conclusões mais decisivas.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] EMBRAPA. A Biotecnologia e as pesquisas da Embrapa Soja. Disponível em <http://www.cnpso.embrapa.br> Acesso em: 27mai. 2005
[2] COLE, D. J. Mode of action of glyphosate – a literature analysis. In: GROSSBARD, E.; ATKINSON, D. (Ed.). The herbicide glyphosate, pp. 49-54. Londres: Butterworths, 1985.
[3] RODRIGUES, J. D. Absorção, translocação e modo de ação de defensivos (glifosato e alachlor). Botucatu: Unesp, 1994. 10 p. Apostila.
[4] EMBRAPA. Transgênicos: Próximas Ondas Disponível em <http://www.cnpso.embrapa.br> Acesso em: 27mai. 2005.
[5] BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Divisão de Laboratório Vegetal. Regras para Análise de Sementes. Brasília. 1992. 365p. 
[6] GUERRA, M.; SOUZA, M.J. Como Observar Cromossomos: um guia de técnica em citogenética vegetal, animal e humana. São Paulo, Funpec, 2002. 131p. 
[7] Disponível em <http://www.icb.ufmg.br.Acesso> em 29 jul. 2005.