CONSTRUÇÃO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO VISANDO A PRODUÇÃO DE VACINA CONTRA COLIBACILOSE SUÍNA EM PLANTAS 

Sant’Anna*1, Anna Lia; ROCHA1, Andréa Ramos; Binsfeld1, Pedro Canísio

1- Centro de Biotecnologia Universidade Federal de Pelotas. Campus Universitário, Caixa Postal 354, 96010-900 – Pelotas-RS, Brasil. *anna_lia@pop.com.br

1. INTRODUÇÃO
A colibacilose suína neonatal é a doença intestinal mais comum que ocorre em leitões, entre 12 horas e 10 dias de idade, sendo a Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) o agente etiológico responsável. A aderência está entre os fatores de patogenicidade da E. coli enterotoxigênica. Outro fator é a colonização na superfície da mucosa das células epiteliais, a qual é mediada por proteínas chamadas fímbrias ou pili. As Fímbrias são os fatores primários de patogenicidade responsáveis pela adesão a receptores de enterócitos. Ao menos 8 genes estruturais estão envolvidos na sua biossintese. Entretanto, cepas de ETEC que produzem o antígeno K88 constituem a maioria das cepas isoladas de leitões com diarréia. A principal subunidade fimbrial é codificada pelo gene faeG e parece ser a responsável pela propriedade adesiva da fímbria.
O uso de plantas como reator biológico para a produção de biomoléculas de interesse comercial pode apresentar vantagens de ordem biológica e econômica.
Recentemente, o uso de plantas como biorreatores tem se tornado de especial interesse, já que permitem a produção de proteínas recombinantes em altas quantidades e com preço relativamente baixo. Dentre os diferentes grupos de proteínas comumente produzidas, as vacinas recombinantes são um dos mais importantes grupos, pois podem apresentar vantagens biológicas muito significativas como: conformação estrutural e funcional apropriada das proteínas, formação de complexos protéicos associados, o que não é possível em bactérias; não apresenta risco de contaminação das vacinas ou proteínas com toxinas ou vírus de animais, uma vez que as plantas não são hospedeiros desses vírus e a transformação de plantas é mais fácil comparada a produção de animais transgênicos.
O objetivo do presente trabalho foi construir um vetor de expressão que possa ser utilizado para transformação de plantas contendo o gene faeG que codifica a subunidade maior da fímbria k88 da E. coli enterotoxigênica, visando a futura produção de uma vacina, contra colibacilose suína, em plantas.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi conduzido no Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas. Para sua execução foram utilizadas diversas técnicas de biologia molecular. O gene faeG foi obtido a partir de uma cepa patogênica de E. coli. O vetor pUS1997 foi linearizado utilizando a enzima de restrição XbaI e tratamento com CIP. Foi feita a ligação do gene faeG com o vetor pUS1997, resultando no vetor denominado de pUP153. Para a clonagem do pUP153 foi realizado a transformação e cultivo de E. coli visando o posterior isolamento do gene faeG o qual posteriormente foi utilizado para a construção do vetor para transformação de plantas pATC940. A extração do DNA plasmidial (pUP153) foi realizado por lise alcalina. O plasmídio obtido foi digerido utilizando a enzima XbaI, com o objetivo de liberar o fragmento de interesse. O produto da digestão foi corrido em gel de agarose 0,8% para posterior  purificação do gene FaeG. Para purificação usou-se o kit GFXTM PCR DNA e Gel Band Purification (Amersham Pharmacia Biotech Inc) que é utilizado na extração de DNA a partir de  bandas no gel de agarose. O gene purificado foi utilizado para construção do vetor de expressão denominado pATC940/faeG.
Na fase seguinte o vetor pATC940 foi preparado para receber o gene faeG, o vetor foi digerido com XbaI e tratado com a fosfatase alcalina (CIP) a fim de impedir que as extremidades do mesmo se religassem, uma vez que foram clivados pela enzima de restrição. A ligação entre o vetor de expressão e o gene foi realizada a 16ºC por duas horas. As céluas competentes de E. coli foram transformadas com a ligação realizada com o vetor pATC940 e o gene faeG como segue: transferiu-se para um microtubo de 1,5 ml estéril , 50l de células competentes e adicionou-se 1l  de DNA do produto da ligação. Essa mistura foi submetida a uma temperatura de 4ºC por 30 minutos, após à temperatura de 42ºC por 45 segundos e novamente a temperatura de 4ºC por 2 minutos. Logo em seguida foi acrescentado 450l de meio de cultura LB líquido e deixado encubar por 1 hora à 37ºC. Logo após, 100l da cultura foram semeados em placas de Petri com meio LB sólido contendo antibiótico, seguido de uma incubação a 37º C overnight. A seleção de colônias recombinantes foi feita mediante cultivo das mesmas em meio líquido seguida por extração de DNA plasmidial e digestão com a enzima XbaI. 
A orientação do inserto e a fase de leitura pode ser verificada pelo sequenciamento do vetor construído pATC940/faeG utilizando primers específicos. 
  O vetor construído será utilizado em futuros trabalhos de transformação de plantas.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram realizadas com sucesso as diferentes etapas da construção de um vetor de expressão. Após extração do plasmídio pPUP153 por lise alcalina o mesmo foi digerido com a enzima XbaI para liberar o inserto (gene faeG). A extração do gene faeG do vetor pUP153 foi confirmada através de eletroforese em gel de agarose pois evidenciou a liberação de um inserto com o tamanho esperado, correspondente ao do gene faeG. Procedeu-se o tratamento do vetor pATC940 com a enzima XbaI e cipagem. Na seqüência o gene faeG foi ligado ao vetor pATC940 utilizando T4 DNA ligase, após ligação realizou-se a transformação de E. coli por choque térmico. A ligação foi confirmada em gel de agarose, pois foi possível observar uma banda em posição mais alta que a banda contendo vetor pATC940, sugerindo que tenha ocorrido a ligação entre o vetor+inserto, isto é, que tenha como resultado um vetor pATC940+faeG ligado. Essa diferença na altura de bandas deve-se a migração diferenciada das moléculas de DNA – amostras com moléculas de DNA maiores migram menos, apresentando-se mais altas no gel de agarose, enquanto que amostras com moléculas de DNA menores migram mais rapidamente, apresentando-se mais baixas no gel. 
A comprovação da construção do vetor de expressão foi concluída mediante a obtenção de clones recombinantes após a transformação de E.coli com o produto da ligação. Os clones recombinantes foram multiplicados e seu plasmídio extraído, o qual foi submetido à digestão enzimática para liberação do inserto. Na Figura 1, observa-se a liberação do inserto pelo plasmídio na amostra 3 acompanhado dos respectivos controles, evidenciando portanto o sucesso na construção do vetor de expressão contendo o gene faeG que codifica a subunidade maior da fimbria K88 da E. coli enterotoxigênica, visando futura produção de uma vacina contra colibacilose suína em plantas.

Figura1: Gel de agarose 0,8% com as amostras de DNA. 1. Marcador ladder 1kb; 2. vetor pATC940 linearizado; 3. pATC940 digerido, com liberação do inserto gene faeG; 4. pATC940 não digerido; 5. inserto gene faeG (1187 pb), controle; 6. Marcador 100pb

4.	CONCLUSÃO

Os resultados do presente trabalho permitem concluir que o isolamento e purificação do gene faeG foi alcançado, permitindo a construção do vetor de expressão. A construção do vetor foi obtida pela ligação do vetor linearizado e desfosforilado com o gene purificado, resultando no vetor de expressão pAT940/faeG; a análise por digestão com a enzima de restrição XbaI, demonstrou a liberação do inserto correspondente ao gene faeG do vetor construído. Assim, o objetivo principal deste trabalho foi alcançado, pois foi possível obter um clone recombinante contendo o vetor construído, o que demonstra a possibilidade de uso do vetor pATC940/faeG como vetor de expressão para ser utilizado na transformação de plantas visando a produção de uma vacina recombinante contra a colibacilose suína, em plantas.  

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] JACOBS, A.A; VENEMA, J.; LEEVEN, R.; PELT-HEERSCHAP, H.; GRAAF, F.K. Inibition of adhesive activity of K88 fibrillae by peptides derived from the K88 adhesin. Journal of Bacteriology. 169(2); 735-41, 1987.
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