CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA DE MEMBRANA EXTERNA DE Leptospira interrogans EM Mycobacterium bovis BCG

DOSSA, Robson Grando1; SEIXAS, Fabiana Kömmling1; FERNANDES, Claudia Hartleben2, ALEIXO, José Antônio2, DELLAGOSTIN, Odir Antônio1.

1Laboratório de Biologia Molecular – Centro de Biotecnologia – UFPel;
2Laboratório de Imunologia Aplicada – Centro de Biotecnologia – UFPel
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. robsondossa@yahoo.com.br

1.	INTRODUÇÃO

A leptospirose vem sendo reconhecida como uma doença infecciosa emergente ou reemergente [1]. Os prejuízos em termos de saúde pública e as perdas econômicas causadas por tal zoonose justificam o uso de vacinas contra leptospirose em humanos ou em populações de animais com risco. Porém, as vacinas disponíveis conferem imunidade pouco duradoura (6 a 12 meses), têm baixa eficácia e são sorovares específicas [2]. Esforços para a identificação de componentes imunogênicos com potencial para o desenvolvimento de vacinas recombinantes resultou na caracterização das proteínas de membrana externa de 31, 32, 36 e 41 kDa [3,4,5,6].
Recentemente uma nova família de proteínas (Ligs) foi descrita. Dados preliminares indicam seu potencial no desenvolvimento de vacinas recombinantes contra leptospirose, pois são proteínas de membrana externa, presentes em todos os sorovares de leptospiras patogênicas e a expressão destas proteínas ocorre somente durante a infecção [7,8].
Já a utilização de BCG como vetor de vacina oferecem uma série de vantagens, tais como: é a vacina mais usada no mundo, pode ser ministrada em dose única após o nascimento, não sendo afetada pelos anticorpos maternos, é um importante adjuvante em experimentos animais, pode ser administrada via oral, é a vacina viva mais estável ao calor e seu custo de produção é baixo [9].  Nos últimos anos, sistemas para a manipulação e expressão de genes heterólogos em micobactérias foram desenvolvidos, permitindo a avaliação do BCG recombinante como um veículo para antígenos virais, bacterianos e parasitários; Inclusive toxinas também tem sido expressas por BCG recombinante com grande sucesso [10].
Assim, o objetivo deste trabalho foi construir uma vacina baseada em BCG recombinante capaz de expressar uma região repetitiva da proteína LigB de Leptospira Interrogans.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Amplificação da seqüência que codifica para as regiões das proteínas Lig B. A regiões de LigB (ligBrep) foi amplificada por PCR com Platinumâ Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) e clonada nos vetores de expressão citoplasmáticos  em micobactérias [11].

Construção dos BCG recombinantes. Para produção das vacinas de BCG recombinante, a cepa de BCG Pasteur foi transformada por eletroporação com os vetores de expressão em micobactérias pUS977 (sob controle do promotor PAN) e pAU5 (sob controle do promotor hsp60) contendo o gene ligBrep, os clones recombinantes foram cultivados em meio liquido seletivo para avaliação da expressão por Western blot, segundo protocolo descrito por Bastos et al. [13]. 

	3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

A amplificação da região do gene Lig B (lig B rep) por PCR foi obtida com uma temperatura de anelamento de 55°C. Uma representação esquemática da disposição do gene lig B com suas respectivas regiões é apresentada na figura 1. O fragmento amplificado foi purificado e ligado nos vetores pUS977 e pAU5. Após transformação de E. coli Top10, clones recombinantes foram identificados e cultivados em meio líquido. O DNA plasmidial extraído destes clones foi digerido com as mesmas enzimas de restrição utilizadas nos primers para confirmar a presença do inserto. As amostras com inserto apresentaram um fragmento correspondente a região do gene clonada e outro correspondente ao tamanho do vetor (Figura 2).

B

A

1        2

ligBct

ligBni

ligBrep

Figura 1. Painel A. Representação esquemática do gene ligB com suas respectivas regiões. Painel B. Coluna 1. Produto de PCR ligBrep (1553 pb); Coluna 2. Marcador de Massa Molecular (Ladder 1kb).

     1         2        3

Figura 2. Digestão com enzimas de restrição dos clones recombinantes. Coluna 1. Marcador de massa molecular 100pb; Coluna 2. pUS977/ligBrep; Coluna 3. pAU 5/ligBrep.

Vetor

Inserto

	Uma proteína do tamanho esperado (~60 kDa) foi detectada por Western Blotting utilizando anticorpo monoclonal anti-LigBrep recombinante em BCG transformado com os vetores pAU5/ligBrep (promotor hsp60), e pUS977/ligBrep (promotor PAN) como mostrado na figura 3. 

        1     2     3     4

Figura 3. Western Blotting de extrato protéico de rBCG expressando a LigBrep, detectado com anticorpo monoclonal anti-LigBrep recombinante.  Coluna 1. BCG (controle); Coluna 2. rLigBrep purificada; Coluna 3: rBCG (pUS977/ligBrep); Coluna 4. (pAU5/ligBrep).

	4. CONCLUSÕES

A região LigBrep da proteína de membrana externa de Leptospira interrogans foi expressa eficientemente sob controle de ambos promotores (hsp 60 de micobactéria e PAN de Mycobacterium paratuberculosis), com níveis equivalentes de expressão.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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[2] Levett, P. N. (2001). Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews 14, 296-299.
[3] Haake, D. A., C. I. Champion, C. Martinich, E. S. Shang, D. R. Blanco, J. N. Miller, and M. A. Lovett. (1993). Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J. Bacteriol. 175:4225-4234.
[4] Haake, D. A., M. K. Mazel, A. M. McCoy, F. Milward, G. Chao, J. Matsunaga, and E. A. Wagar. (1999). Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection. Infection and Immunity 67:6572-6582.
[5] Shang, E. S., M. M. Exner, T. A. Summers, C. Martinich, C. I. Champion, R. E. Hancock, and D. A. Haake. (1995). The rare outer membrane protein, OmpL1, of pathogenic Leptospira species is a heat-modifiable porin. Infection and Immunity 63:3174-3181.
	[6]  Shang, E. S., T. A. Summers, and D. A. Haake. (1996). Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infection and Immunity  64:2322-2330.
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[12] Cevenini, R., V. Sambri, S. Pileri, G. Ratti, and M. La Placa. (1991). Development of transplantable ascites tumours which continuously produce polyclonal antibodies in pristane primed BALB/c mice immunized with bacterial antigens and complete Freund's adjuvant. Journal Immunology Methods 140:111-118.
[13] Bastos, R. G., O. A. Dellagostin, R. G. Barletta, A. R. Doster, E. Nelson, and F. A. Osorio. (2002). Construction and immunogenicity of recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing GP5 and M protein of porcine reproductive respiratory syndrome virus. Vaccine 21:21-29.