ESTUDO DA ATIVIDADE DA INVERTASE ÁCIDA SOLÚVEL EM MICROTUBÉRCULOS E PARTE AÉREA DE BATATAS OBTIDAS IN VITRO

Trevizol, Fábio Cristiano1, Santos, Lívia Scheunemann1; Zanatta, Eduardo2; Peters, José Antonio1, Bacarin, Marcos Antonio2 e Braga, Eugenia Jacira Bolacel1

1Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas – Departamento de Botânica/IB – UFPel
2Laboratório de Metabolismo Vegetal - Departamento de Botânica/IB – UFPel

1.	INTRODUÇÃO

A produtividade da batata tem estado abaixo dos níveis esperados, devido a vários fatores, entre eles, a baixa qualidade do material propagativo utilizado pelos agricultores, às técnicas convencionais de cultivo empregadas e às condições edafoclimáticas, que em determinados locais e épocas do ano são desfavoráveis ao desenvolvimento normal da cultura [1]. Diante disso, a micropropagação e a produção de microtubérculos in vitro, surgem como alternativas para a produção de batata semente com elevado status fitossanitário, além de apresentar as vantagens de ocupar pouco espaço de armazenamento e maior facilidade de intercâmbio de germoplasma [2]. Microtubérculos apresentam também, vantagens para estudo do metabolismo, em relação aos produzidos em condições de campo, por permitirem um estádio de colheita precisamente definido e com material seguramente mais homogêneo que os produzidos a campo [3]. 
Durante os estádios primários de desenvolvimento dos tubérculos, algumas enzimas, como a invertase e a sacarose sintase, exercem papel fundamental na conversão de açúcares, que serão utilizados em rotas metabólicas como a glicólise, ou posterior formação de amido [4]. A hidrólise da sacarose, pela invertase ácida solúvel, representa a principal rota de degradação da sacarose durante o alongamento e crescimento dos estolões, enquanto que no desenvolvimento dos tubérculos uma das enzimas mais atuantes é a sacarose sintase [2], sendo responsável pela clivagem da sacarose em frutose e UDP-Glicose.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade da enzima invertase ácida solúvel e suas interações com os níveis de carboidratos estruturais e não estruturais em microtubérculos e parte aérea de batata cvs. Asterix e Pérola.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados como explantes iniciais, segmentos nodais de plantas de batata, cvs. Asterix e Pérola, mantidas in vitro em meio MS, no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas do Departamento de Botânica da UFPel.
Para obtenção dos microtubérculos, os explantes foram cultivados, inicialmente, em meio MS [6], com quatro concentrações de sacarose (20, 40, 60 e 80 g L-1), sem complementação hormonal e mantidos em câmara de crescimento com temperatura de 25±1ºC, com fotoperíodo de 16 horas e três densidades de fluxo de fótons (42, 63 e 98 µmol m-2 s-1), providas por lâmpadas fluorescentes brancas-frias, durante 40 dias. Decorrido este período, aos frascos onde se encontravam as plantas, foi adicionado 20 mL de meio MS líquido contendo 80 g L-1 de sacarose, 500 mg L-1 de CCC (cicocel), 10 mg L-1 de BAP e 200 mg L-1 de KNO3, sendo o pH ajustado para 5,7. Os frascos foram colocados em um germinador sob temperatura de 221ºC, no escuro, por um período de 40 dias para indução dos microtubérculos. Após esse período avaliou-se o melhor tratamento para as variáveis número e a massa fresca dos microtubérculos formados e massa fresca da parte aérea das plantas (dados não apresentados). A partir desses resultados foram escolhidos dois tratamentos contrastantes e determinaram-se os teores de amido, açúcares redutores e carboidratos solúveis totais, utilizando material liofilizado dos microtubérculos e parte aérea das plantas oriundas destes tratamentos. 
O extrato protéico bruto foi obtido a partir de 250 mg de massa liofilizada dos microtubérculos e da parte aérea, e a partir deste determinou-se a atividade da invertase ácida baseada na produção de açúcares redutores, segundo metodologia adaptada por Mendes et al. [5].
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em um esquema fatorial 2x2, sendo duas condições de cultivo in vitro (40 g L-1 de sacarose com 42 µmol m-2 s-1 de densidades de fluxo de fótons e 80 g L-1 de sacarose com 98 µmol m-2 s-1 de densidades de fluxo de fótons - DFF) e duas cultivares (Asterix e Pérola). Foram utilizadas quatro repetições por tratamento.
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan, através do SANEST-Sistema de Análise Estatística [9]. 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

	Foram verificadas interações entre os fatores condição de cultivo in vitro x cultivar para atividade da invertase ácida solúvel da parte aérea (Tabela 1). A maior atividade da invertase ácida solúvel foi observada na cv. Asterix no tratamento com 80 g L-1 de sacarose e 98 µmol m-2s-1 de DFF, conferindo com os maiores teores de açúcares redutores encontrados nesta condição de cultivo. Na cv. Pérola, ao contrário, os maiores teores foram no tratamento com 40 g L-1 de sacarose e 42 µmol m-2 s-1 de DFF (Tabela 3).
	
TABELA 1 – Atividade média específica da invertase ácida (μg de glicose h-1) da parte aérea de plantas de batata, cvs. Asterix e Pérola

Cultivar	Condição de cultivo in vitro	
	40 g L-1/  42 µmol m-2 s-1	80 g L-1/  98 µmol m-2 s-1	
Asterix	   539,01   bB	1641,99 aA	
Pérola	1215,55 aA	  637,33   bB	
(1) Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade; letras minúsculas comparam na coluna; letras maiúsculas comparam na linha.
 
A alta atividade da invertase na parte aérea das plantas indicou uma maior produção de açúcares redutores, que podem ter sido utilizados em rotas metabólicas, principalmente da glicólise, ao invés de estar sendo translocada para os tubérculos para posterior conversão em amido [8].
A maior atividade da invertase ácida solúvel observada na cv. Asterix, na condição de 80 g L-1 de sacarose e 98 µmol m-2 s-1 de DFF é correspondente a um maior acúmulo de amido observado no mesmo tratamento. Da mesma maneira pode-se deduzir que o maior teor de amido verificado no tratamento com 40 g L-1 de sacarose e 42 µmol m-2s-1 de DFF na cv. Pérola está associada a maior atividade da invertase nesta mesma condição de cultivo.
Na análise dos microtubérculos, também foi registrada interação entre os fatores condição de cultivo x cultivar para a atividade da invertase ácida solúvel (Tabela 2). Na cv. Asterix a maior atividade específica da invertase ácida solúvel foi verificada na condição de cultivo in vitro de 80 g L-1 de sacarose e 98 µmol m-2 s-1 de DFF, ao passo que na cv. Pérola foi com 40 g L-1 de sacarose e 42 µmol m-2s-1 de DFF. 

TABELA 2 – Atividade média específica da invertase ácida (μg de glicose h-1) nos microtubérculos de batata, em relação às condições de cultivo in vitro x cultivares

Cultivar	Condição de cultivo in vitro	
	40 g L-1/  42 µmol m-2 s-1	80 g L-1/  98 µmol m-2 s-1	
Asterix	466,43 bA	893,51 aA	
Pérola	1023,94 aA	225,88   bB	
(1) Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade; letras minúsculas comparam na coluna; letras maiúsculas comparam na linha.

Comparando todos os dados de bioquímica quantitativa e atividade da invertase ácida solúvel, para parte aérea (Tabela 3), na cv. Asterix a maior atividade desta enzima foi verificada na condição de cultivo com 80 g L-1/ 98 µmol m-2 s-1, onde observou - se ao mesmo tempo um maior teor de amido, carboidratos solúveis totais e açúcares redutores.
Na parte aérea da cv. Pérola, a maior atividade da invertase ocorreu na condição de cultivo de 40 g L-1/ 42 µmol m-2 s-1, onde foi encontrado um maior teor de amido, e menores teores de açúcares redutores e carboidratos solúveis totais. 

Tabela 3 – Teores de carboidratos e atividade da invertase da parte aérea de plantas de batata cultivadas em diferentes condições in vitro

	Parte aérea	
Tratamento	Invertase ácida solúvel 
(μg de glicose h-1)	Amido 
(mg g-1)	Carboidratos solúveis totais 
(mg g-1)	Açúcares
redutores(mg g-1)	
Asterix 40 g L-1/  42 µmol m-2 s-1	539,01	8,51	83,15	46,20	
Asterix 80 g L-1/  98 µmol m-2 s-1	1641,99	18,04	89,11	65,92	
Pérola 40 g L-1/  42 µmol m-2 s-1	1215,55	16,42	70,78	47,95	
Pérola 80 g L-1/  98 µmol m-2 s-1	637,33	7,31	88,82	72,43	

A maior atividade da invertase nos microtubérculos da cv. Pérola pode ter sido responsável pelo maior teor de amido nesta cultivar (Tabela 4). Possivelmente o aumento de sacarose estimulou a atividade de outra enzima, como a sacarose sintase [7].
Na cv. Asterix a maior atividade da invertase no tratamento com 80 g L-1 de sacarose e 98 µmol m-2 s-1 de DFF pode ter sido responsável pelos maiores teores de carboidratos solúveis totais e estar relacionado com a menor concentração de amido verificada nesta cultivar (Tabela 4).
Analisando em conjunto os resultados referentes aos microtubérculos, a alta atividade da invertase e os maiores teores de açúcares redutores e carboidratos solúveis totais na cv. Asterix foram na condição de cultivo com 80 g L-1/ 98 µmol m-2 s-1, igualmente à parte aérea. Ao contrário, na cv. Pérola, somente o maior teor de amido foi associado à alta atividade da invertase na condição de cultivo de 40 g L-1/ 42 µmol m-2 s-1.
Na cv. Pérola, tanto na parte aérea como em microtubérculos, a alta atividade da invertase estaria associada a uma maior formação de amido, indicando que pode ter ocorrido à ação de outras enzimas na conversão das hexoses geradas pela quebra da sacarose, em virtude dos menores teores de açúcares redutores e carboidratos solúveis totais obtidos.
	Na cv. Asterix, o teor de amido dos microtubérculos não variou entre as condições de cultivo, somente foram verificadas variações nos teores de açúcares redutores e carboidratos solúveis totais.

Tabela 4 – Teores de carboidratos e atividade da invertase de microtubérculos de batata cultivadas em diferentes condições in vitro

	Microtubérculos	
Tratamento	Invertase ácida solúvel 
(μg de glicose h-1)	Amido 
(mg g-1)	Carboidratos solúveis totais 
(mg g-1)	Açúcares
redutores(mg g-1)	
Asterix 40 g L-1/  42 µmol m-2 s-1	466,43	408,44	17,85	3,58	
Asterix 80 g L-1/  98 µmol m-2 s-1	893,51	432,46	36,45	10,26	
Pérola 40 g L-1/  42 µmol m-2 s-1	1023,94	731,39	12,85	5,49	
Pérola 80 g L-1/  98 µmol m-2 s-1	225,88	611,71	28,94	10,91	

4. CONCLUSÕES

A alta concentração de sacarose aplicada durante a fase de indução dos microtubérculos faz com que as plantas acumulem maiores teores de açúcares redutores e carboidratos solúveis totais, ocasionados pela maior atividade da invertase ácida solúvel. As cultivares Asterix e Pérola, testadas neste experimento, respondem de maneira diferente às condições de cultivo in vitro aplicadas.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] AL-SAFADI, B.; AYYOUBI, Z.; JAWDAT, D. The effect of gamma irradiation on potato microtuber production in vitro. Plant Cell Tissue and Organ Culture, v.61, p.183-187, 2000.
[2] APPELDOORN, N.J.G.; SERGEEVA, L.; VREUGDENHIL, D.; VAN DER PLAS, L.H.W.; VISSER, R.G.F. In situ analysis of enzymes involved in sucrose to hexose-phosphate conversion during stolon-to-tuber transition of potato, Physiologia Plantarum , v.115,  p.303–310, 2002.
[3] COLEMAN, W.K.; DONNELLY, D.J.; COLEMAN, S.E. Potato microtubers as research tools: a review. American Journal of Potato Research, v.78, p.47–55, 2001.
[4] HAJIREZAEI, M.; TAKAHATA, Y.; TRETHEWEY R. N.; WILLMITZER L.; SONNEWLD U. Impact of elevated cytosolic and apoplastic invertase activity on carbon metabolism during potato tuber development. Journal of Experimental Botany, v.51, GMP special Issue, p.439-445, 2000.
[5] MENDES, C.R.; BACARIN, M.A.; BERVALD, C.M.P.; TREVIZOL, F.C.; LOPES N. F. Purificação parcial de uma invertase ácida solúvel de tubérculos de batata armazenados em baixa temperatura, Revista Ceres, UFV, no prelo, 2005. 
[6] MURASHIGE, T. & SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco culture tissues. Physiologia Plantarum, v.15, p.473-497, 1962.
[7] SOWOKINOS, J.R. & VARNS, J.L. lnduction of sucrose synthase in potato tissue culture: Effect of carbon source and methodic regulators on sink strength. Journal of Plant Physiology, n.139, p.672-679, 1992.
[8] TRETHEWAY, R. N.; GEIGENBERGER, P.; RIEDEL, K.; HAJIREZAEI, M. R.; SONNEWLD, U.; STITT, M.; RIESMEIER, J.W.; WILLMITZER, L. Combined expression of glucokinase and invertase in potato tubers leads to a dramatic reduction  in starch accumulation  and a stimulation of glycolysis. Plant Journal, n.15, p.109-118, 1998.
[9] ZONTA, E.P. & MACHADO, A.A. SANEST: Sistema de análise estatística para computador. Registrado na Secretaria Especial de Informática (SEI), sob nº 066-060 – categoria A, Pelotas, 1984.