TRANSFERABILIDADE DE PRIMERS PARA ANÁLISE DE LOCOS MICROSSATÉLITES (SSR) ENTRE ARROZ E TRIGO

NASSI, Fernanda de Lima1; SANTOS, Lívia Scheunemann1; TURCHETTO, Andréia Carina1; ZANANDREA, Ilisandra1; RIBEIRO, Márcia Vaz1; BRAGA, Eugenia Jacira Bolacel1; BONOW, Sandro2; PETERS, José Antonio1

1Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas – Botânica – UFPel;
2Universidade de Livramento - UERGS
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. fernandanassi@yahoo.com.br

1.	INTRODUÇÃO

As espécies de cereais com maior importância econômica pertencem à família Poaceae, como trigo (Triticum aestivum L.), arroz (Oryza sativa L.) e milho (Zea mays L.) [11]. Os genomas das gramíneas, que divergiram a mais de 65 milhões de anos, são diferentes em termos de tamanho, nível de ploidia e número cromossômico; contudo, estudos comparativos demonstraram que a colinearidade dos genes é geralmente bem preservada entre diferentes genomas de gramíneas [6]. Novos métodos utilizando marcadores moleculares são essenciais para atingir um conhecimento mais eficiente entre espécies relacionadas. O trigo hexaplóide é uma espécie com um genoma extenso e complexo, que se beneficiou de estudos comparativos com genomas mais simples, como o do arroz, para melhor compreensão de sua organização cromossômica [4]. 
Marcadores de microssatélites ou SSR (simple sequence repeat) são uma ferramenta útil para inúmeros propósitos como mapeamento e identificação de características de interesse, sendo muito usados por sua abundância, codominância, alto polimorfismo e fácil análise. Contudo, eles foram identificados e estão disponíveis apenas para algumas espécies de importância econômica, devido ao alto custo, além do extenso trabalho necessário em seu desenvolvimento. Mapeamentos comparativos revelaram alto grau de colinearidade entre espécies relacionadas, o que permite a troca de marcadores moleculares entre elas. Marcadores de SSR são de grande utilidade no estudo das interações entre espécies botânicas intimamente relacionadas [7,9]. Portanto, a aplicação de marcadores de SSR desenvolvidos em uma espécie, e aplicados em outra, é chamada “transferabilidade”, sendo proposta e demonstrada com sucesso em inúmeras espécies [8]. O objetivo deste trabalho foi examinar a transferabilidade de marcadores de SSR desenvolvidos a partir do genoma do arroz (Oryza sativa L.) em trigo (Triticum aestivum L.).

2.	MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratório de cultura de Tecidos de Plantas, do Departamento de Botânica, Instituto de biologia da Universidade Federal de Pelotas.

2.1 Material vegetal

Foi utilizada a cultivar de trigo BRS 120, obtida junto ao Centro de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado (CPACT/EMBRAPA). 
As sementes foram inicialmente submetidas à desinfestação com álcool 70% por 1 min., hipoclorito de sódio comercial 50% por 10 min., sob agitação mecânica, sendo posteriormente lavadas 3 vezes com água destilada estéril. A seguir, foram colocadas em meio MS [8] com a concentração de sais reduzida a metade da sua concentração normal, sendo acrescentado ao meio 50 mg L-1de mio-inositol, 15 g L-1 de sacarose e 6,0 g L-1 de ágar para solidificar. O pH foi ajustado, antes da autoclavagem, para 5,8. A esterilização dos meios de cultura foi feita por autoclavagem a 120°C por um período de 20 minutos. As sementes foram mantidas in vitro em câmara de crescimento a uma temperatura de 25±2°C, fotoperíodo de 16 horas e densidade luminosa de 48 mol m-2 s-1 durante 40 dias para posterior extração de DNA.

2.2 EXTRAÇÃO DE DNA

O DNA foi extraído a partir de folhas de plântulas jovens, seguindo o protocolo proposto por Ferreira & Grattapaglia [3]. 

2.3 AMPLIFICAÇÃO DO DNA 

Foram testados primers flanqueadores a microssatélites desenhados para amplificar regiões expressas em arroz [1]. Os 10 pares de primers selecionados para a amplificação do DNA de trigo, visando a transferabilidade, foram: Primer 1F/R, 2F/R, 3F/R, 4F/R, 5F/R, 6F/R, 7F/R, 8F/R, 9F/R, e 10F/R.
 A amplificação foi realizada em um termociclador modelo MJ. PTC 100 utilizando o seguinte perfil térmico de amplificação: 3 minutos a 94ºC, seguidos de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 30 segundos a 72°C, finalizando a reação de amplificação, 10 minutos a 72ºC. Nas reações de PCR foram utilizados 16 ng de DNA; 2 L de 10x PCR buffer; 1,2 L de MgCl2 (25 mM); 2 L de cada primer (2 pmol); 2 L de dNTPs (1 mM); 0,4U de Taq DNA polimerase e 2,72 L de água Milli-Q, em um volume final de 20 L.
Foram aplicados 10 L da reação de amplificação e 3 L de tampão de amostra em gel de agarose 2,0% corado com Brometo de Etídio na concentração de 0,10 gm L-1 e visualizado sob luz UV. A eletroforese foi realizada em cuba horizontal (Bio Rad) com tampão TBE a 100 volts por 40 minutos.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O protocolo de extração utilizado possibilitou a obtenção de DNA de qualidade para a realização do PCR [3,2]. 
Os resultados obtidos na eletroforese em gel de agarose mostraram que dos dez primers analisados, apenas os primers 2, 3, 6 e 9 amplificaram microssatélites no genoma da cultivar BRS120 (Figura 1). Os primers que amplificaram mostram que provavelmente existem genes presentes no genoma do arroz encontrados também no genoma do trigo [10]. Já os que não amplificaram, provavelmente não tenham regiões do genoma similares. 

                           M      1      2       3      4       5       6       7      8      9      10	
	
Figura 1: Eletroforese em gel de agarose do produto do PCR com a cultivar de trigo BRS 120. Coluna 1, marcador de massa molecular  HindIII; Primer 1,  Primer 2, Primer 3, Primer 4, Primer 5, Primer 6, Primer 7, Primer 8, Primer 9, Primer 10, respectivamente.  
 
Destaca-se que os primers utilizados flanqueiam microssatélites posicionados em regiões supostamente expressas do genoma do trigo. Isto demonstra que provavelmente genes presentes no genoma do arroz também são encontrados no genoma do trigo.

4. CONCLUSÕES

Através desse resultado, conclui-se que é viável o estudo de espécies relacionadas a partir de genomas seqüenciados como, por exemplo, o arroz.
É possível utilizar marcadores de microssatélites desenvolvidos a partir do genoma do arroz em trigo.

(Projeto Apoiado pela Capes)

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BONOW, S. Caracterização morfológica, isoenzimática e molecular de cultivares de arroz (tese de Doutorado). Lavras: UFLA, 2004.
[2] CARDOSO, E.T.; NEDEL, J.L. Padrões eletroforéticos de cultivares de trigo indicadas para região sul do Brasil. Ciência Rural, Santa Maria, v.32, n.2, p.203-209, 2002.
[3] FERREIRA, M.E. E GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao Uso de Marcadores RAPD e RFLP em Análise Genética. Embrapa - Cenargem, Brasília, 220 p., 1995.
[4] GUPTA, P.K.; RUSTGI, S.; SHARMA, S.; et al. Tranferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat. Mol. Gen.  Genomics, v.270, p.315-323, 2003.
[5]Gupta, P. K.; Rustgi S.; Sharma, S.; Singh, R.; Kumar, N.; Balyan, H. S. Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat. Mol Gen Genomics, v.270, p. 315–323, 2003.
 [6] KULEUNG, C.; BAENZIGER, P. S.; DWEIKAT, I. Transferability of SSR markers among wheat, rye and triticale. Theor Appl Genet, v.108, p.1147–1150, 2004.
[7] LA ROTA, M.; KANTETY, R.V.; YU, J-K AND SORRELLS, M.E. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice, wheat, and barley. BMC Genomics, v.6, p.23, 2005.
[8] MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco culture tissues. Physiological Plant, v.15, p.473-497, 1962.
[9] VARSHNEY, R.K.; GRANER, A; SORRELLS, M.E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. TRENDS in Biotechnology v.23 n.1, p. 48-55, 2005
[10] VARSHNEY, R.K.; SIGMUND, R.; BÖRNER, A., KORZUN, V.; STEIN, N.; SORRELLS, M.E., LANGRIDGE, P. and GRANER, A. Interspecific transferability and comparative mapping of barley EST-SSR markers in wheat, rye and rice. Plant Science v. 68, n.1, p.195-202, 2005. 
[11] Yu J.K.; La Rota, M.; Kantety, R. V.; Sorrells, M. E. EST derived SSR markers for comparative mapping in wheat and rice. Mol Gen Genomics, v. 271, p.742–751, 2004.