IMUNOGENICIDADE DE UMA VACINA DE DNA CONTRA LEPTOSPIROSE
SEIXAS, Fabiana Kömmling1; DOSSA, Robson1; CONCEIÇÂO, Fabrício Rochedo1; FERNANDES, Claudia Hartleben2, ALEIXO, José Antônio2, DELLAGOSTIN, Odir Antônio1.

1Laboratório de Biologia Molecular – Centro de Biotecnologia – UFPel;
2Laboratório de Imunologia Aplicada – Centro de Biotecnologia – UFPel
Campus Universitário  – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. fabianak@ufpel.edu.br

1.	INTRODUÇÃO

A leptospirose, doença causada por bactérias do gênero Leptospira, é classificada como uma antropozoonose direta de ampla distribuição geográfica, que ocorre de forma endêmica no mundo inteiro [1]. Os prejuízos em termos de saúde pública e as perdas econômicas causadas pela leptospirose justificam o uso de vacinas contra leptospirose em humanos ou em populações de animais com risco. O desenvolvimento de vacinas para prevenção da leptospirose humana tem sido reportado em alguns países. Vários experimentos encontram-se em fase pré-clinica e clínica, em Cuba [2] e na Rússia [3]. 
Vários trabalhos têm sido publicados indicando o potencial da proteína LipL32, como sendo uma OMP (proteína de membrana externa) forte candidata no desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose. Análises do perfil protéico das proteínas das leptospiras indicam LipL32 como a proteína mais proeminente, sendo a principal proteína de membrana externa [5]. A seqüência e a expressão de LipL32 são altamente conservadas entre espécies de leptospiras patogênicas e está ausente na membrana externa de leptospiras não patogênicas, além disso, LipL32 é expressa durante a infecção no hospedeiro sendo altamente antigênica [6]; >95% de pacientes com leptospirose produzem anticorpos contra LipL32 durante infecção [7]. 
As vacinas de DNA possuem diversas vantagens, como estabilidade e baixo custo de produção, com a possibilidade de se utilizar um mesmo vetor para diversos antígenos. As vacinas de DNA também podem ser utilizadas em crianças em fase de amamentação, sem a possibilidade de interferência de anticorpos maternos, como ocorre com a vacinação tradicional [8].
	Assim, o objetivo deste trabalho foi o de construir um plasmídeo de expressão em eucarioto que contenha o gene lipL32 de Leptospira interrogans visando a obtenção de uma vacina de DNA e avaliar a imunogenicidade desta vacina gênica em camundongos.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção do gene lipL32. A seqüência do gene lipL32 foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira interrogans Icterohemoragie Copenhageni L1 130 (FIOCRUZ-BA). Os “primers” para o lipL32 foram desenhados a partir das seqüências depositadas no GenBank. O PCR foi realizado em um volume final de 50 µL, contendo 50 ng de DNA genômico, 6 ng.µL-1 de cada oligonucleotídeo, 1 unidade de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen), MgCl2 2 mM, dNTP 0,2 mM e 10% de tampão 10x da enzima Taq DNA polimerase. A reação foi submetida a um passo de desnaturação inicial (94°C, 5 min), seguido por 30 ciclos de desnaturação (94°C, 1 min), anelamento (50°C, 1 min) e extensão (72°C, 1 min). Após os 30 ciclos, a reação foi submetida a um ciclo final de extensão a 72°C por 7 min.
Clonagem do lipL32 no vetor pTargeT. O fragmento amplificado no PCR foi clonado no vetor pTargeT contido no pTARGET™ Mammalian Expression Vector System (Promega, USA) segundo instruções do fabricante. O produto da ligação foi usado para transformar E. coli DH5 por choque térmico como descrito anteriormente. Colônias que surgiram na placa foram submetidas a uma triagem rápida pelo método microprep [9]. Clones que apresentavam o inserto foram selecionados e cultivados. Deste cultivo foi extraído DNA plasmidial e digerido com a enzima de restrição BamHI. Um plasmídio recombinante cujo inserto estava na orientação horária foi selecionado e denominado pTarget/lipL32 . Este clone foi cultivado em um volume de 300 mL de LB, nas condições descritas anteriormente, e submetido à extração de DNA em larga escala usando o kit Perfectprep Plasmid Maxi (Eppendorf, Alemanha).
Vacinação e Avaliação da Imunogenicidade. Os animais foram divididos em três grupos, Vacina de DNA (pTargeT - controle), Salina (controle) e Vacina de DNA (pTarget/lipL32). A inoculação de camundongos com 2 doses de 100 µg cada de cada vacina por via intramuscular . Trinta minutos antes da aplicação da vacina, os animais receberam, no mesmo local da aplicação, 50 g de sacarose 25%.  A resposta imune foi monitorada por ELISA com o soro individual de cada animal, onde o antígeno utilizado foi à proteína LipL32 purificada e por imunofluorescência indireta.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Obtenção da Vacina de DNA. Foi extraído DNA plasmidial de possíveis clones recombinantes, estes foram digeridos com a enzima de restrição BamHI, confirmando a presença do inserto. Um clone recombinante foi selecionado e denominado pTargeT/lipL32. O mapa deste plasmídio encontra-se na figura 1. Para verificar a eficiência da extração plasmidial, bem como a concentração em que se encontravam os plasmídios, submeteu-se amostras, diluídas nas proporções de 1/500 e 1/1000, do DNA extraído a uma eletroforese em gel de agarose. O resultado foi analisado por um programa de documentação de fotos de géis, que permitiu concluir que os plasmídios haviam sido extraídos numa concentração de 1 g/ml (figura 1). 

   1        2      3

       A                                                                B	

Figura 1. Construção da Vacina de DNA. Painel A é o esquema do mapa de restrição do plasmídeo pTargeT/lipL32. Painel B é o gel de agarose 0,8%, da extração de DNA plasmídeal. Coluna 1: marcador de massa molecular (lambda DNA/Hind III); Coluna  2: pTargT (2L); coluna 3: pTargeT/lipL32 (2L)

Avaliação da resposta imune humoral induzida pela vacina de DNA. A inoculação de camundongos com 2 doses de 100 µg cada de pTargeT/lipL32 por via intramuscular foi capaz de induzir uma resposta imune específica contra a proteína LipL32. O teste de ELISA realizado com soro de animais imunizados com a vacina de DNA apresentou título diferenciado a partir do 63º dia após a primeira inoculação, quando comparado com os grupos controles salina e somente o vetor pTarget (figura 2).

Figura 2: Resposta imune apresentada em Unidades de ELISA de camundongos inoculados com a vacina de DNA (pTarget/lipL32) e dos grupos controles (salina e pTarget). 

Além disso, o soro dos animais vacinados com pTarget/lipL32 foi utilizado em uma Imunofluorescência indireta e foi  capaz de reconhecer a proteína na membrana externa das Leptospiras como observado na figura 3.

B

A

B

A

Figura 3. Imunofluorescência Indireta. Painel. A, Imunofluorescência com pool de soro dos animais vacinados com pTarget/lipL32; Painel. B, Imunofluorescência com pool de soro dos animais controles negativos.

4. CONCLUSÕES

Os camundongos vacinados com esta vacina gênica apresentaram resposta imune humoral, detectada através de um ELISA indireto em níveis elevados e significativos comparados com os grupos controles. O soro dos animais vacinados com pTarget/lipL32 foi capaz de reconhecer a proteína na membrana externa da Leptospira. Estes resultados indicam potencial do antígeno LipL32 no desenvolvimento de uma vacina efetiva contra leptospirose.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Bharadwaj, R. (2004). Leptospirosis - a reemerging disease? Indian Journal of Medical Research 120, 136-138.
[2] Martinez, S. R., Perez, S. A., Baro, S. M., Alvarez, A. M., Menendez, H. J., Diaz, G. M., Cruz, d. l. P., de los, R. G., Montoya, B. B., Sierra, G. G., Armesto, d. R., Saltaren, C. A., & Sabournin, R. O. (2000). Evaluation of the effectiveness of a new vaccine against human leptospirosis in groups at risk. Rev.Panam.Salud Publica 8, 385-392. 
[3] Ikoev, V. N., Gorbunov, M. A., Vachaev, B. F., Iagovkin, E. A., Kondratenko, V. F., Anan'ina, I., Ansimova, T. I., Kostina, N. I., Iur'eva, I. L., & Nikitin, M. G. (1999). The evaluation of the reactogenicity and immunogenic activity of a new concentrated inactivated leptospirosis vaccine. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 39-43.
[4] Martinez, R., Perez, A., Quinones, M. C., Cruz, R., Alvarez, A., Armesto, M., Fernandez, C., Menendez, J., Rodriguez, I., Baro, M., Diaz, M., Rodriguez, J., Sierra, G., Obregon, A. M., Toledo, M. E., & Fernandez, N. (2004). Efficacy and safety of a vaccine against human leptospirosis in Cuba. Rev.Panam.Salud Publica 15, 249-255.
 [5] Haake, D. A. (2000a). Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology 146, 1491-1504.
[6] Haake, D. A., Chao, G., Zuerner, R. L., Barnett, J. K., Barnett, D., Mazel, M., Matsunaga, J., Levett, P. N., & Bolin, C. A. (2000b). The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infection and Immunity 68, 2276-2285.
[7] Guerreiro, H., Croda, J., Flannery, B., Mazel, M., Matsunaga, J., Galvao, R. M., Levett, P. N., Ko, A. I., & Haake, D. A. (2001). Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans. Infection and Immunity 69, 4958-4968.
[8] Ada, G. & Ramshaw, I. (2003). DNA vaccination. Expert.Opin.Emerg.Drugs 8, 27-35.
[9] Jouglard, S. D., Medeiros, M. A., Vaz, E. K., Bastos, R. G., Cunha, C. W., Armoa, G. R. G., & Dellagostin, O. A. An Ultra-Rapid and Inexpensive Plasmid Preparation Method for Screening Recombinant Colonies. Abstracts American Society for Microbiology H 71, 234. 2002.