estabelecimento e multiplicação in vitro de TOMILHO (Thymus vulgaris l.)

LIMA, Cláudia Simone Madruga1; RIBEIRO, Márcia Vaz1; SANTOS, Lívia Scheunemann1; BANDEIRA, Juliana de Magalhães1; PETERS, José Antonio1 e BRAGA, Eugenia Jacira Bolacel1

1Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas – Departamento de Botânica – IB/UFPel;
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. claudialim@pop.com.br

1.	INTRODUÇÃO

Devido à grande popularidade das plantas medicinais e da medicina natural, o estudo sobre o assunto vem crescendo atualmente, o que proporciona investimento em pesquisas para a ampliação do conhecimento sobre os compostos fitoterápicos presentes nas espécies de interesse [8, 10]. 
A família Lamiaceae tem distribuição cosmopolita, sendo de grande importância, principalmente medicinal e condimentar [4], podendo ser utilizada na culinária, indústria de perfumes e também como aromatizante de licores [5]. Principalmente pela presença de óleos essenciais aromáticos, voláteis e como plantas ornamentais [3, 12]. O tomilho, Thymus vulgaris L., é uma espécie originária da Europa, sendo que seu óleo essencial contém timol, carvacrol, cimol, borneol, linalol, cimeno e pineno, além de taninos. 
A micropropagação in vitro consiste de uma metodologia eficiente na produção de mudas com alta qualidade fitossanitária e genética. Essa técnica vem sendo utilizada com sucesso para a obtenção de mudas sadias em grande número de espécies economicamente importantes ou com dificuldade de propagação, obtendo avanços importantes nos campos de genética, fisiologia e patologia [9].
Este trabalho teve por objetivo determinar a melhor condição para desinfestação de sementes de T. vulgaris L. e avaliar a ação de diferentes meios para multiplicação in vitro desta espécie. 

2.	MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas do Departamento de Botânica do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas. Como material vegetal, utilizou-se sementes comerciais não tratadas de Tomilho.  
Para o estabelecimento da cultura in vitro foi utilizado o meio MS básico [6], semi-sólido (7g L-1 de ágar), sem adição de reguladores de crescimento, distribuídos em frascos de vidro autoclavados sob temperatura de 121º C e 1,5 atm por 20 minutos.
As sementes de Tomilho foram inicialmente lavadas em água destilada estéril e duas gotas de detergente neutro por um período de 15 minutos sob agitação mecânica e, em câmara de fluxo laminar foram imersas por 15 segundos em etanol 70% e lavadas em água destilada estéril. Subseqüentemente, as sementes foram submetidas a três diferentes períodos de exposição (15, 20 e 30 minutos) combinados com três diferentes concentrações de hipoclorito de sódio (1%, 1,5% e 2%). Na seqüência foram lavadas em água destilada estéril, secas em papel filtro e inoculadas no meio de estabelecimento, totalizando cinco sementes por frasco avaliadas ao final de 20 dias quanto à porcentagem de germinação e contaminação.
Os explantes com melhor aspecto foram transferidos para meio MS, a fim de eliminar resíduos da desinfestação, onde permaneceram durante 30 dias em sala de crescimento com temperatura de 25±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e fluxo luminoso de 48 μmol m-2  s-1.
Após este período, segmentos nodais com aproximadamente 0,5 cm foram utilizados como explante para experimento de multiplicação. Os explantes foram transferidos para o meio MS acrescido de três concentrações de BAP - benzilaminopurina (0; 0,1 e 0,5 mg L-1). Em cada frasco foram inoculados cinco explantes, onde permaneceram em sala de crescimento com condições de temperatura e luz controladas, conforme descrito anteriormente.  Ao final de 20 dias foi feita a avaliação das variáveis altura e número de brotos.
Para o experimento de estabelecimento foi utilizado um delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema fatorial, 3x3, sendo três concentrações de hipoclorito e três tempos de exposição. Para a multiplicação, avaliou-se três tratamentos (0, 0,1 e 0,5 mg L-1 de BAP) compostos de cinco repetições, representadas cada uma por um frasco contendo cinco explantes. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em todos os tratamentos foi observada baixa taxa de contaminação, não sendo verificada diferença significativa entre os tratamentos utilizados na desinfestação das sementes.
Para a porcentagem de germinação verificou-se interação significativa entre tempo e concentração de hipoclorito, obtendo 60% na concentração 1% de hipoclorito em 15 e 20 minutos de exposição (Tabela 1). O aumento da concentração e/ou tempo de exposição ao hipoclorito, demonstrou ser prejudicial ao processo de germinação de T. vulgaris, o mesmo encontrado por LIMA et al. [7], em estudos com sementes de anis (Pimpinella anisium L.), onde verificaram que a germinação in vitro foi afetada por altas concentrações de hipoclorito.

Tabela 1. Porcentagem de sementes germinadas, após 20 dias em meio de cultivo, de Thymus vulgaris submetidas à desinfestação com diferentes concentrações de hipoclorito e tempos de exposição.

Concentração de hipoclorito (%)	Tempo (minutos)	
	15	20	30	
1,0	60	a  A	60	a  A	12	b B	
1,5	28 	  bA	4	  b   B	8	b B	
2,0	52 	a  A	16	  b   B	4	b B	
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúsculas na linha não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

A variável altura das plantas cultivadas no meio MS sem adição de BAP diferiu significativamente dos demais tratamentos (Tabela 2), enquanto os tratamentos com 0,1 e 0,5 mg L-1 de BAP não diferiram entre si, alcançando 1,26 e 1,29 cm de altura, respectivamente. TURCHETTO et al. [11] verificaram que para a variável altura de Tagetes sp, os melhores resultados foram obtidos com zero de BAP, corroborando os dados encontrados no presente trabalho. Foi observado que a ausência de BAP no meio de cultivo promove maior formação de brotos por explante (Tabela 2). Entretanto, Chaturvedi et al. [1], em trabalho com jojoba (Simmondsia chinensis Schneider), verificaram o aumento da média de 5 para 15 brotos por explante quando estabelecidos em meio contendo BAP na concentração de 0,5 mg L−1. 

Tabela 2. Média da altura e do número de brotos dos explantes de Thymus vulgaris submetidas a diferentes concentrações de BAP durante 20 dias em meio MS

Concentração de BAP (mg L-1)	Altura (cm) 	Número de brotos	
0	2,88 a	                3,08 a	
0,1	              1,26    b	                1,40    b	
0,5	              1,29    b	                1,96    b	
* Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

4. CONCLUSÕES

Altas concentrações de hipoclorito e maior tempo de exposição afetam a germinação in vitro dessa espécie, enquanto que o meio MS sem a presença de substâncias reguladoras de crescimento é mais adequado para multiplicação in vitro de Thymus vulgaris L.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Chaturvedi, H. C.; Sharma, M. In vitro production of cloned plants of jojoba (Simmondsia chinensis Schneider) through shoot proliferation in long-term culture. Plant Science. v. 63, Issue 2 , 1989, Pages 199-207 
[2] DINIZ, J. D. N.; ALMEIDA, J. L.; TEIXEIRA, A. L. A. de; GOMES, E. S.; HERNANDEZ, F. F. F. Ácido giberélico (GA3) e 6-benzilaminopurina (BAP) no crescimento in vitro de Macela [Egletes viscosa (L.) Less.]. Capturado em 30/05/2005. On line. Disponível em:  http://www.editora.ufla.br/revista/27_4/art28.htm., 1998
[3] LEUNG, A.Y. Encyclopedia of common natural ingredients used in food, drugs and cosmetic. New York – Chichester: Wiley, 1980.
[4] LIMA, C.S.M.; SANTOS L.S.; SCHMITZ, D.D.; BEDUHN, F.A.; BRAGA, E.J.B. ESTABELECIMENTO E GERMINAÇÃO IN VITRO DE Pimpinella anisium L. In: XIII Congresso de iniciação científica UFPel, 2004, Pelotas, 2004.
[5] Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 29th edition. (Reynolds, JEF, editor). London: The pharmaceutical Press, 1993.
[6] MARTINS, E.R., CASTRO, D.M., CASTELLANI, D.C. & DIAS, J.E. Plantas medicinais. Editora UFV. Viçosa, MG. Universidade Federal de Viçosa. 2000.
[7] Murashige, T.; Skoog. F. Physiol. Plant., 1962, 15, 473-497. 
[8] NEWALL, C.A.; ANDERSON, L.A.; PHILLIPSON, J.D. Fitoterapia – Plantas Medicinais: Guia para Profissionais da Saúde. Ed. Premier. São Paulo, 2002.
[9] PAIVA, P. D. de O. Estabelecimento in vitro de estrelícia (Strelitzia reginae Ait.) e controle de oxidação com identificação dos compostos liberados no meio de cultura. 1998. 84 p. Tese (Doutorado em Fitotecnia) – Universidade Federal de Lavras, 1998.
[10] PANIZZA, S. Plantas que curam – Cheiro de mato. Ed. Ibrasa. 24ª edição. São Paulo, 2001.
[11] TURCHETO, Andreia ; NASSI, Fernada de Lima ; ZANANDREA, Ilisandra ; FIGUEIREDO, Paula de ; PETERS, José Antônio ; BRAGA, Eugênia Jacira B . Multiplicação In Vitro de Tagetes sp.. Anais...: 2ºcongresso Brasileiro de Cultura de Tecidos, 2005, Fortaleza-CE, 2005.
[12] VANDEN BROUCKE CO. The therapeutic value of Thymus species. Fitoterapia; v. 4: 171-4, 1983.